莫 玲，香慶文，李晶晶，葉玉萍，趙超超

(桂林醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

蛋白質(zhì)是孕哺期非常重要的營養(yǎng)物質(zhì)，該時期攝取的蛋白質(zhì)的質(zhì)量直接關(guān)系到母嬰健康，尤其在對胎兒的健康非常重要。原乳及乳制品中含有較多的不飽和脂肪酸、氧化酶和金屬催化劑類等成分，可能會在加工和貯藏過程中誘導(dǎo)乳蛋白發(fā)生氧化，使其理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響營養(yǎng)品質(zhì)，甚至可能會產(chǎn)生有害化合物[1-4]。前期研究證實(shí)，孕哺期攝入氧化乳蛋白膳食后，子代小鼠腸道抗氧化防御能力和學(xué)習(xí)記憶能力均受到影響[5-6]。在乳制品中，脂肪和蛋白質(zhì)都是非常重要的營養(yǎng)成分，乳脂肪氧化對乳制品的影響已被大眾所接受，但是乳蛋白氧化尤其是乳脂肪氧化與乳蛋白氧化之間的關(guān)系及對機(jī)體的影響仍未引起大家的關(guān)注。Ventanas等[7]和Soyer等[8]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物有明顯的相關(guān)性，脂肪的氧化會促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化，而蛋白質(zhì)氧化往往也會伴隨著脂肪的氧化[9]。前期研究證實(shí)，脂肪含量降低，蛋白質(zhì)氧化程度下降[10]。目前，孕哺期膳食中，飼喂不同脂肪含量的氧化乳蛋白對子代小鼠氧化還原狀態(tài)及健康狀況研究較少，本研究希望通過建立孕哺期不同脂肪含量的氧化蛋白飲食小鼠模型，系統(tǒng)研究氧化乳蛋白對子代小鼠氧化還原狀態(tài)的影響，為孕哺期的飲食提供一定理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶，市售純牛奶；HCl、NaOH、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三氯乙酸(trichloroethanoic acid，TCA)，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(hydrogen peroxidase，CAT)、脂質(zhì)過氧化物丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，HNE)試劑盒，廈門慧嘉生物有限公司；KM小鼠SCXK桂2013-0001，桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

DW- 86L828J型醫(yī)用超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；S- HH- W21- 600S型電熱恒溫三用水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Elx808型多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限(中國)有限公司；DD5型臺式乳脂離心機(jī)，湖南赫西儀器有限公司；CTFD- 12S型冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1氧化乳蛋白制備

1.3.1.1 全脂氧化乳蛋白制備

全脂乳蛋白質(zhì)量濃度為3.2 g/100 mL，將0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液與全脂乳混合制備成蛋白質(zhì)含量為20 mg/mL的溶液，置于燒杯中，在100 ℃條件下水浴加熱90 min，加熱期間用玻璃棒連續(xù)攪拌。冷卻后冷凍干燥處理，于-20 ℃保存、備用。采用凱氏定氮法測定凍干乳粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是20.3%。

1.3.1.2 低脂氧化乳蛋白制備

將全脂乳加熱至40 ℃，在轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心30 min，去除上層乳脂得到低脂乳，將0.05 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液與低脂乳混合制備成蛋白質(zhì)含量為20 mg/mL的溶液，置于燒杯中，在100 ℃條件下水浴加熱90 min，加熱期間用玻璃棒連續(xù)攪拌。冷卻后冷凍干燥處理，于-20 ℃保存、備用。采用索氏抽提法測定其脂肪密度為1.9 g/100 mL。采用凱氏定氮法測定凍干乳粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是24.6%。

1.3.2乳蛋白氧化指標(biāo)的測定

以未經(jīng)氧化的純牛乳為空白對照組，測定全脂氧化乳蛋白和低脂氧化乳蛋白樣品中羰基、游離巰基含量。游離巰基含量測定按照Boatright的方法[11]，羰基含量測定按照Oliver的方法[12]。

1.3.3實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)

清潔級KM小鼠，雄性9只，雌性18只，7周齡，體重20～22 g。在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房觀察室以正常飼料預(yù)飼1周，觀察其體重、糞便、進(jìn)食、飲水、活動狀態(tài)等情況，剔除病弱小鼠后按體重隨機(jī)分為3組，每組小鼠雌雄比例為2∶1合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓作為合籠成功依據(jù)。合籠成功后飼喂氧化乳蛋白日糧，以未做氧化修飾的乳蛋白制備空白對照組飼料；飼養(yǎng)3周后，繁殖產(chǎn)生子代小鼠，持續(xù)飼喂哺乳期雌性小鼠氧化乳蛋白日糧3周，子代小鼠斷乳，隔離并對各組子代小鼠進(jìn)行組織樣本采集。各組日糧乳蛋白含量相同，配方見表1(日糧配方按照GB 14924.3—2001《小鼠繁殖飼料營養(yǎng)成分》要求配制)。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng)，保持衛(wèi)生清潔、自由飲食、飲水，溫度(23±2)℃，濕度60%，自然光照。

背景介紹：2018年11月14日，邢福義先生《寄父家書》出版座談會在北京商務(wù)印書館文津廳召開。邢先生的老朋友陳章太、戴慶廈、商務(wù)印書館總經(jīng)理于殿利、華中師范大學(xué)原副校長黃永林、華中師范大學(xué)北京校友會會長李宇明、《光明日報(bào)》國學(xué)版主編梁樞等出席，陸儉明、張振興、周海清、田小琳等知名學(xué)者發(fā)來視頻或書面發(fā)言。座談會由商務(wù)印書館總編輯周洪波主持。

表1 孕哺期雌性小鼠日糧配方Tab.1 Diet formulation of female mice during gestation and lactation

1.3.4組織樣本的采集

子代小鼠禁食12 h，稱重，乙醚輕微麻醉，立即解剖，腹主動脈取血，將所取血液置于預(yù)先用肝素鈉處理的離心管內(nèi)，-80 ℃保存、待測。然后取小鼠的腸、肝、腎、腦稱重，將所取出的各組織于冰浴條件下加入生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，-80 ℃保存，用于測定氧化還原指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量對牛乳中蛋白質(zhì)氧化的影響

羰基是蛋白質(zhì)氧化的一個比較顯著變化，而且相對來說較易測量[13]。蛋白質(zhì)的變性作用會導(dǎo)致羰基含量的升高，且在氧化過程中，蛋白質(zhì)羰基化的產(chǎn)生是不可逆的[14-15]。一般情況下蛋白質(zhì)中羰基衍生物形成主要有以下4個途徑[16]: 1、肽骨架的斷裂; 2、氨基酸側(cè)鏈的直接氧化; 3、結(jié)合非蛋白羰基化合物; 4、與還原糖發(fā)生反應(yīng)。有研究表明，氨基酸側(cè)鏈易受自由基攻擊產(chǎn)生，氨基酸殘基氧化形成的羰基會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失[17-19]，所以羰基被廣泛用于測量不同氧化作用下, 蛋白質(zhì)損傷的程度。

對脂肪含量不同的牛乳進(jìn)行氧化修飾，凍干乳粉的乳蛋白中羰基含量結(jié)果見圖1。由圖1可知，與未經(jīng)加熱氧化的空白對照組牛乳相比，經(jīng)氧化修飾后全脂組和低脂組乳蛋白的羰基含量升高；全脂組和低脂組相比，低脂組羰基的含量低于全脂組。結(jié)果表明，不同脂肪含量的乳蛋白氧化都會導(dǎo)致乳中羰基含量變化，脂肪含量越高，乳中羰基含量越高。

**表示差異極顯著P<0.01。圖1 脂肪含量對牛乳氧化修飾蛋白中羰基含量的影響Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content in oxidized milk protein

蛋白質(zhì)中的巰基基團(tuán)是十分活潑的，且具有很高的抗氧化活性。吳伶艷等[20]等證實(shí)了經(jīng)過MDA氧化修飾后，大豆蛋白中的巰基減少、羰基化合物增加，且經(jīng)電泳實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過MDA 氧化修飾后大豆蛋白發(fā)生聚集現(xiàn)象，使得大豆蛋白溶解度出現(xiàn)顯著性下降。對脂肪含量不同的牛乳進(jìn)行氧化修飾，乳蛋白中巰基含量結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，不同脂肪含量的乳蛋白經(jīng)氧化修飾后，與空白組對比，全脂組和低脂組乳蛋白的巰基含量明顯下降(P<0.05)；全脂組和低脂組相比，全脂組巰基含量比低脂組低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同脂肪含量的乳蛋白氧化都會影響巰基的變化，且隨著脂肪含量上升，乳蛋白中巰基含量越低。結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。

*表示與空白組對比差異顯著P<0.05。 圖2 脂肪含量對牛乳氧化修飾蛋白中巰基含量的影響Fig.2 Effect of fat content on sulfhydryl content in oxidized milk protein

2.2 孕哺期攝入氧化乳蛋白的影響

2.2.1對子代小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的影響

經(jīng)過對子代小鼠腸、肝、腎和腦中的MDA與HNE測量，與飼喂未添加氧化乳蛋白日糧的雌性小鼠相比，發(fā)現(xiàn)MDA和HNE在子代小鼠體內(nèi)積累，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖3和圖4。與空白對照組(飼喂未添加氧化乳蛋白日糧的雌性小鼠)相比，飼喂添加氧化乳蛋白日糧的全脂組與低脂組MDA和HNE含量明顯升高；全脂組與低脂組相比，全脂組MDA和HNE含量比低脂組高。這表明隨著脂肪含量的升高，MDA和HNE在機(jī)體內(nèi)聚集越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在孕哺期攝食氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠機(jī)體受到明顯的損傷。

*表示與空白組對比差異顯著P<0.05。圖3 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對子代 小鼠組織中MDA含量的影響Fig.3 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on MDA content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

*表示與空白組對比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖4 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對子代 小鼠組織中HNE含量的影響Fig.4 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on HNE content in tissues of offspring mice during gestation and lactation

2.2.2對子代小鼠體內(nèi)氧化還原酶活力的影響

在一般情況下，機(jī)體體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)能抑制自由基的產(chǎn)生，維持細(xì)胞正常的生理功能。常見的機(jī)體內(nèi)氧化還原酶有CAT、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶。

CAT是一類以過氧化氫為專一底物的酶，存在于動物的各個組織中，尤其是在肝臟中。它能促使自由基上的電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，而且使其分解成氧和水，進(jìn)而抵御自由基傷害機(jī)體。

*表示與空白組對比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖5 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對子代 小鼠組織中CAT活性的影響Fig.5 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on CAT activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

SOD在抑制機(jī)體氧化防御系統(tǒng)中起到了非常重要的作用。機(jī)體抵御自由基的第一防線是SOD，在超氧陰離子產(chǎn)生后，其產(chǎn)生的連鎖反應(yīng)會損害機(jī)體的細(xì)胞。通過在孕哺期飼喂氧化乳蛋白日糧3周，經(jīng)過對子代小鼠腸、肝、腎和腦中的CAT與SOD測量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖5、圖6。與空白組相比，全脂組與低脂組的各組織中CAT和SOD含量明顯下降；全脂組與低脂組相比，全脂組的CAT和SOD比低脂組含量低；說明隨著脂肪含量的升高，機(jī)體中CAT和SOD的含量明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孕哺期飼喂經(jīng)氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠腸、肝、腎和腦的氧化還原酶活力均有不同程度的降低。

*表示與空白組對比差異顯著P<0.05，** 表示差異極顯著P<0.01。圖6 孕哺期飼喂含氧化乳蛋白乳粉日糧對子代 小鼠組織中SOD活性的影響Fig.6 Effect of feeding milk powder containing oxidized milk protein on SOD activity in tissues of offspring mice during gestation and lactation

3 結(jié) 論

孕期和哺乳期是子代各組織器官發(fā)育的關(guān)鍵時期，該時期的營養(yǎng)變化尤其是作為生命物質(zhì)基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)對后期嬰幼兒的整體發(fā)育有密切的聯(lián)系。研究結(jié)果表明氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白中羰基和巰基的含量產(chǎn)生了變化，在雌性小鼠孕哺期攝入氧化修飾脂肪含量不同的乳蛋白后，子代小鼠也受到了影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與未經(jīng)加熱氧化的牛乳相比，全脂組與低脂組羰基含量升高，巰基含量降低。孕哺期飼喂氧化修飾不同脂肪含量乳蛋白日糧后，子代小鼠氧化還原酶活力降低、MDA和HNE在子代小鼠體內(nèi)積累。說明孕哺期攝入氧化修飾脂肪含量不同的乳蛋白會引發(fā)子代小鼠氧化還原狀態(tài)的改變，且脂肪含量越高，狀態(tài)改變越明顯。原因可能是脂肪氧化產(chǎn)生大量自由基，從而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生氧化；另外，脂肪氧化產(chǎn)生的大量的脂質(zhì)過氧化物也會攻擊蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)的氧化[24]，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物在機(jī)體積累從而引起子代小鼠的氧化還原狀態(tài)失衡[25-27]。為避免這種狀態(tài)的發(fā)生，在乳制品加工中，可以考慮通過將乳脂肪與乳蛋白分離來降低因氧化造成的乳制品營養(yǎng)價(jià)值的損失。本研究可以為了解不同脂肪含量乳蛋白對機(jī)體產(chǎn)生的影響以及對孕哺期的飲食提供一定的理論依據(jù)，但脂肪對蛋白質(zhì)氧化影響及對子代機(jī)體影響的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。