孟斌，郭繁霞，王紅梅，孫培明，薛聰*

一起雞H9亞型禽流感和傳染性支氣管炎共感染病例的診斷

孟斌1，郭繁霞2，王紅梅3，孫培明1，薛聰*1

（1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.臨沂科技職業(yè)學(xué)院，山東 臨沂；3.山東省莒南縣檢驗(yàn)檢測中心，山東 莒南）

為了對送檢的一起以呼吸道癥狀為主要臨床表現(xiàn)，以氣管黏膜彌漫性出血、肺臟出血為主要剖檢變化的病例進(jìn)行診斷，本試驗(yàn)采集病死雞組織樣本進(jìn)行RT-PCR以及測序鑒定。結(jié)果表明，使用H9亞型禽流感病毒HA基因、雞傳染性支氣管炎病毒M基因特異性引物，分別可以擴(kuò)增獲得528 bp、740 bp的目的片段。測序分析結(jié)果進(jìn)一步確證該病例為H9亞型禽流感病毒和雞傳染性支氣管炎病毒混合感染所致。

隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，雞的傳染病尤其是呼吸道疫病的發(fā)生逐漸增加并趨于復(fù)雜化。在雞群中，有一類由多種致病因子協(xié)同作用，形成很難用針對單個(gè)病原體的方法防制的復(fù)合型呼吸道疾病[1]。其中，禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）H9亞型和傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是臨床常見的兩種呼吸道病毒。

H9亞型AIV屬于正黏病毒科，A型流感病毒屬，是H9亞型禽流感（Avian influenza, AI）的病原。雞感染H9亞型AI后會(huì)出現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低、免疫力降低。IBV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），冠狀病毒屬（Coronavirus），可以導(dǎo)致雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）。IBV主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降、產(chǎn)畸形蛋以及腹瀉。H9亞型AI和IB兩種呼吸道疾病都能通過空氣在雞群迅速傳播，咳出的飛沫經(jīng)呼吸道傳播，經(jīng)污染的飲水、飼料等間接地經(jīng)消化道傳播，并且兩者的混合感染時(shí)有發(fā)生[2]。本試驗(yàn)基于山東省臨沂市某雞場的呼吸道癥狀病雞，經(jīng)臨床診斷初步確定為H9亞型AI和IB混合感染，進(jìn)一步采集組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測、測序驗(yàn)證，最終確診為H9亞型AIV和IBV混合感染。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、M-MLV購自杭州新景生物公司；RNA酶抑制劑、2×Taq PCR MasterMix（含染料）購自北京索萊寶生物公司；dNTP Mixture（10 mM）購自寶日醫(yī)生物公司；GeneGreen核酸染料、DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技公司。無水乙醇、DEPC等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 樣品采集與處理 2019年12月，山東臨沂某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的25日齡雛雞出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀，大群表現(xiàn)為精神不振、食欲減退，咳嗽、噴嚏、氣管啰音，并伴有呼吸困難表現(xiàn)。癥狀嚴(yán)重的雛雞迅速消瘦，繼而死亡，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。剖檢病死雞，記錄眼觀病變，并采集氣管、肺臟等病料作為檢測樣品。

1.3 核酸提取 將采集的病理組織樣品，按照核酸提取試劑盒說明書所述方法提取核酸，用于后續(xù)病原檢測。

1.4 病原檢測 根據(jù)GenBank發(fā)表的H9亞型AIV HA基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對特異性檢測引物Flu-H9-F、Flu-H9-R（見表1）。IBV檢測引物參照《雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》（GB/T 23197-2008）。另外，參照文獻(xiàn)[3]方法對送檢樣品進(jìn)行NDV、ILTV、FAV檢測。試驗(yàn)所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄（RT）為10 μl體系：5×M-MLV Buffer 2 μl、dNTP Mixture（10 mM）0.5 μl、Random Primers（25 μm）1 μl、RNA酶抑制劑 0.5 μl、M-MLV1 μl，RNA Template 5 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，42 ℃孵育60 min，95 ℃ 5 min，最后在冰上冷卻，用于后續(xù)PCR反應(yīng)。PCR采用20 μl反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，特異性上游、下游引物各1 μl，cDNA模板2 μl，補(bǔ)加ddH2O至20 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，34個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠呈像儀下觀察結(jié)果。

1.5 測序分析 參照《雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)》檢測與判定標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將上述RT-PCR獲得的IBV擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后送生工生物公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行BLAST分析。以上述同樣方法，對RT-PCR獲得的H9亞型AIV擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序與分析。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病變 對病死雞進(jìn)行剖檢，呼吸系統(tǒng)的病理變化非常明顯，主要表現(xiàn)為：氣管黏膜彌漫性出血，黏膜表面有較多黏液。有的病例發(fā)生支氣管栓塞，管腔中有黃色栓塞物。肺臟出血、腫脹，呈暗紅色。采集有明顯病變的肺臟、氣管樣本用于后續(xù)病原檢測。

2.2 病原檢測 病原檢測結(jié)果表明：使用H9亞型AIV特異性引物Flu-H9-F、Flu-H9-R可以擴(kuò)增獲得約528bp大小的目的片段（圖1A）；而使用IBV特異性引物IBV-Ms、IBV-Mx可以擴(kuò)增獲得約740bp大小的目的片段（圖1B），電泳結(jié)果均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相一致。樣本的NDV、ILTV、FAV檢測結(jié)果均為陰性。RT-PCR檢測結(jié)果初步表明：該病例存在H9亞型AIV與IBV混合感染。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

A. H9亞型AIV鑒定; B. IBV鑒定M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-2分別為臨床樣本、陰性對照

2.3 測序分析 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，送生物公司測序。使用NCBI數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明：上述H9亞型AIV PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果與A/chicken/ Jiangsu/J2177/2017（H9N2）株（登錄號MK 553996）核苷酸序列同源性最高，為99.6 %；參考株J2177屬于國內(nèi)流行較為廣泛的Y280-like分支。IBV PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果與IBV YX10株（登錄號JX840411）核苷酸同源性最高，為99.8 %；IBV參考株YX10屬于QX型。測序分析結(jié)果進(jìn)一步確證該病例存在H9亞型AIV與IBV混合感染。

3 討論

（1）雞的呼吸道傳染病一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病。AIV和IBV作為雞呼吸道疾病的常見病原體，在我國許多地區(qū)均有報(bào)道[4]。禽流感有多個(gè)亞型，在我國流行最為廣泛的是H9亞型AIV，在分類上屬于低致病性禽流感病毒（LPAIV）。H9亞型AIV感染雞后，常表現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋量、種蛋受精率、孵化率會(huì)受到較大影響，并且會(huì)導(dǎo)致免疫力降低[5]。（2）雖然單純H9亞型AIV感染死亡率一般不高，但是當(dāng)與IBV等病原共感染時(shí)，會(huì)加重雛雞的臨床癥狀以及病理變化，導(dǎo)致較高的發(fā)病率和死亡率，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,6]。近年來，AIV與IBV混合感染現(xiàn)象在國內(nèi)多地均有發(fā)生：2010-2013年從山東、遼寧、吉林、黑龍江等地規(guī)?；怆u場采集的111份H9亞型AIV陽性樣品中，有74份同時(shí)檢測到IBV陽性，混合感染率高達(dá)67 %，雞群死亡率達(dá)10 % 以上[4]?；旌细腥镜膮f(xié)同致病作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致雞的呼吸道疾病愈加嚴(yán)重、防控更加困難的重要原因[1]。（3）目前，疫苗免疫接種是預(yù)防H9亞型AI和IB等呼吸道傳染病的重要舉措。雖然H9僅是A型流感病毒的1個(gè)亞型，但其譜系復(fù)雜，容易出現(xiàn)變異甚至抗原性改變，導(dǎo)致AIV很難得到有效控制。另外，目前眾多的H9亞型AIV疫苗也給養(yǎng)殖戶選用疫苗造成了諸多困惑[7]。如果選擇的疫苗毒株與現(xiàn)場流行毒株的抗原性不相符，免疫雞群仍可能會(huì)出現(xiàn)疫情。本研究中H9亞型AIV PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果與Y280-like分支的H9N2參考毒株J2177/2017株同源性最高。Y280-like分支屬于國內(nèi)流行較為廣泛的H9亞型AIV，因此應(yīng)選擇與流行株抗原性匹配的Y280-like分支疫苗用于防控。與H9亞型AIV相似，IBV也處于不斷變異之中。IBV血清型較多，且各血清型間交叉保護(hù)作用差異較大，這為IB防控帶來挑戰(zhàn)[3]。本研究中IBV PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果與QX型的毒株YX10株同源性最高。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的QX型是目前山東省雞群中IBV流行的主要基因型相一致[3]。因此IB的免疫防控應(yīng)選擇QX型疫苗，或者與4/91型疫苗、H120疫苗聯(lián)合使用。（4）為了有效防控AI和IB，除了有針對性的選擇與流行株基因型、抗原性相匹配的疫苗，還應(yīng)注意疫苗免疫水平，制定科學(xué)合理的免疫程序。最后值的注意的是，疫苗免疫接種只是防控AI和IB流行的最后一道防線，只有結(jié)合平時(shí)飼養(yǎng)管理、生物安全、疫病防控等綜合措施，才能取得滿意的效果。

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-11-17）；山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金（ZR2019PC031）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201910452007）

（2021–01–30）

S858.3

B

1007-1733（2021）05-0026-03