許玲涵，葛平萍，王金亮，王殿永，張洪學(xué)，李金波，李富金*

一株貉源犬細(xì)小病毒CPV-CL01株的分離鑒定

許玲涵1，葛平萍2，王金亮3，王殿永1，張洪學(xué)2，李金波2，李富金2*

（1.河北省昌黎縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 昌黎 066600；2.齊魯動(dòng)物保健品有限公司技術(shù)服務(wù)部，山東 濟(jì)南；3.山東省臨沂市畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，山東 臨沂）

為了探究河北某貉養(yǎng)殖場引起貉腸炎的病原，以便采取針對性防控措施，解決當(dāng)前貉腸炎發(fā)病率高、死亡率高的問題。本研究對采集的病料進(jìn)行了常規(guī)處理，離心取上清液，采用血凝試驗(yàn)、細(xì)胞接種、傳代培養(yǎng)、分離毒PCR鑒定、序列分析、動(dòng)物回歸等方法進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，貉腸炎病料上清液有血凝性，血凝值為l:128，接種貓腎細(xì)胞（F81細(xì)胞），盲傳3代，F(xiàn)81細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，經(jīng)鑒定分離的病毒為細(xì)小病毒，基因比對為犬細(xì)小病毒（CPV-CL01株）。貉回歸試驗(yàn)可復(fù)制出病毒性腸炎典型臨床病癥及病變，是一強(qiáng)毒株。

貉；細(xì)小病毒；分離；鑒定

貉細(xì)小病毒性腸炎是由細(xì)小病毒引起貉的一種急性、烈性、高度接觸性病毒性傳染病，以病貉嘔吐、劇烈腹瀉、高發(fā)病率和死亡率為主要特征，是危害貉業(yè)養(yǎng)殖與發(fā)展的重要傳染病之一。貉細(xì)小病毒性腸炎常由犬細(xì)小病毒、水貂細(xì)小病毒或者狐貍細(xì)小病毒引起，最常見為犬細(xì)小病毒[1-3]。最初的犬細(xì)小病毒為CPV-2，隨著VP2蛋白上的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)不斷發(fā)生變化，新的突變株CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c逐步出現(xiàn)，代替了原來的CPV-2型，宿主范圍也在不斷擴(kuò)大[4]。近幾年，吉林、黑龍江等地均有貉細(xì)小病毒分離的報(bào)道，分型大部分屬于犬細(xì)小病毒CPV-2型[5-8]。筆者從送檢的疑似貉病毒性腸炎的貉小腸內(nèi)容物中分離出一株細(xì)小病毒，經(jīng)鑒定分離株屬于犬細(xì)小病毒CPV-2型，命名為CPV-CL01株，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 河北省秦皇島市昌黎縣某貉養(yǎng)殖場送檢的疑似貉病毒性腸炎的病貉，糞便經(jīng)抗原快速檢測試紙（韓國金諾）檢測為陽性，采集該貉小腸及內(nèi)容物，置-15℃ 以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)細(xì)胞 貓腎傳代細(xì)胞F81，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司研究所自備。

1.1.3 PCR引物 根據(jù)GenBank公布的犬細(xì)小病毒序列，針對細(xì)小病毒VP2基因設(shè)計(jì)一對引物，具體序列如下：P1：5’-ATGAGTGATGGAG CAGTTCAACCAGACGGTGGTCAAC-3’P2：5’-TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAGATTTTTCA-3’，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司研究所自備。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 購自德州某養(yǎng)貉場60日齡左右健康仔貉，血凝抑制抗體效價(jià)（HI）≤1:4。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 取病貉的小腸及內(nèi)容物剪碎，加生理鹽水制成l:10的乳劑，混勻研磨，12 000 r/min離心20 min，取上清，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，置于-15℃ 以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血凝（HA）效價(jià)測定 采用微量血凝試驗(yàn)，用1 % 豬紅細(xì)胞懸液測定病料上清液、細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝特性，以50 % 以上紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集判定為陽性。

1.2.3 病毒分離 將F81細(xì)胞按照常規(guī)方法消化，按照1/10體積同步接種待分離樣品，37 ℃培養(yǎng)24 h后，更換成維持液于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，并逐日觀察細(xì)胞病變；如無細(xì)胞病變，細(xì)胞培養(yǎng)4～5 d收獲，并連續(xù)傳代培養(yǎng)，至第4代仍無病變可認(rèn)定為陰性。出現(xiàn)細(xì)胞病變培養(yǎng)物于-20℃，凍融3次后冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 用DNA提取試劑盒提取病毒液DNA模板，進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，55 ℃ 45秒，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物連同引物送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 貉回歸試驗(yàn) 選擇HI抗體≤l:4的健康貉6只，分為兩組，第一組4只，經(jīng)食道灌服分離病毒，15 ml/只，另2只經(jīng)食道灌服正常細(xì)胞培養(yǎng)物，作為對照，分別隔離觀察飼養(yǎng)10 d，每天觀察臨床癥狀，并于攻毒第3天開始收集攻毒貉糞便，試驗(yàn)第10天撲殺全部貉進(jìn)行病理剖檢。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)結(jié)果

用0.5 % 豬紅細(xì)胞測定病料上清液的血凝特性，結(jié)果發(fā)生凝集反應(yīng)，HA滴度為l:128。

2.2 病毒分離結(jié)果

采用同步接毒方法將處理的病料上清液接種F81細(xì)胞，盲傳至第3代，F(xiàn)81細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、破碎的典型細(xì)小病毒感染細(xì)胞病變（圖1-A），收獲病毒液，-15℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分離毒PCR鑒定結(jié)果及序列比對

分離毒株用PCR方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果1 700 bp處出現(xiàn)目的條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果與NCBI上的貉細(xì)小病毒（RDPV）、貓細(xì)小病毒（FPV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、水貂腸炎病毒（MEV）毒株序列使用MegAign軟件進(jìn)行比對，結(jié)果分離毒株與貉細(xì)小病毒及犬細(xì)小病毒處于同一分支，核苷酸同源性為99.3 % ~ 99.4 %（圖3、圖4），通過對分離毒株與貉細(xì)小病毒及犬細(xì)小病毒氨基酸位點(diǎn)分析，除了101位和297位氨基酸位點(diǎn)與CPV-2有差異，其它氨基酸位點(diǎn)與CPV-2一致（表1），因此，分離毒株可以確定為CPV-2型，將分離毒株命名為CPV-CL01株。

圖1 病毒接種F81細(xì)胞病變情況

圖2 分離病毒液PCR鑒定結(jié)果

1：DL2000marker；2：分離病毒液

表1 分離毒株關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

圖3 分離株基因進(jìn)化樹分析（框內(nèi)為分離毒株）

123456789101112131415 1 98.998.998.998.898.799.099.098.999.599.599.299.699.599.41MEV-LHV KT899745.1.seq 21.2 100.099.999.499.399.599.799.498.898.996.699.098.899.12RDPV HeB10-3 KJ194463.1.seq 31.20.0 99.999.499.399.599.799.498.898.998.699.098.899.13RDPV LN10-1 KJ194462.1(1).seq 41.20.10.1 99.399.499.599.799.498.898.998.699.098.899.14RDPV-SD(10)1 KP685412.seq 51.20.60.60.7 99.399.399.499.498.798.898.698.998.798.85CPV-CL01.seq 61.30.70.70.70.8 99.799.499.798.598.798.598.798.698.66CPV-FJ005196 type2c.seq 71.00.50.50.50.70.3 99.799.898.798.998.799.098.898.87CPV-M24003.1 type2a.seq 81.00.30.30.30.60.60.3 99.598.999.098.899.199.099.08CPV-M38245.1 type2.seq 91.10.60.60.60.60.30.20.5 98.798.998.698.998.798.79CPV-M74849 type2b.seq 100.21.21.21.21.31.51.31.21.3 99.599.599.499.299.310FPV-Bobcat-ND-979-2013 KJ813893.1.seq 110.51.21.21.21.21.31.11.01.10.5 99.399.599.399.311FPV-Raccoon-MA-188-2012 KJ813895.1.seq 120.81.41.41.41.41.61.31.21.40.50.7 99.399.099.112FPV-Raccoon-TX-Rac3-1978 KM524023.1.se 130.41.01.01.01.11.31.00.91.10.60.50.7 99.599.813MEV-Abashin.seq 140.51.21.21.21.31.41.21.01.30.8071.00.5 99.514MEV-L FJ592174.1.seq 150.60.90.90.91.31.41.21.01.300.70.70.90.20.5 15MEV-L.KT899746.1.seq 123456789101112131415

2.4 貉回歸試驗(yàn)結(jié)果

接種的4只貉經(jīng)3～5 d潛伏期后，均出現(xiàn)厭食、嘔吐，初期排稀便，之后出現(xiàn)混有脫落腸黏膜的稀便和血便，體溫升高40 ℃左右。剖檢見貉尸體脫水、消瘦，胃、腸道充血，腸黏膜條狀出血，腸系膜淋巴結(jié)水腫。攻毒5日后測定試驗(yàn)貉糞便，其HA滴度均在1:512以上。

3 討論

（1）從疑似病毒性腸炎貉的腸內(nèi)容物中用F81細(xì)胞分離出一株細(xì)小病毒，分離毒可以很好凝集1 % 豬紅細(xì)胞，PCR鑒定及序列分析表明分離的病毒為犬細(xì)小病毒。動(dòng)物回歸試驗(yàn)可以看出，分離的病毒為強(qiáng)毒株，可導(dǎo)致無母源抗體健康幼貉感染并出現(xiàn)典型腸炎癥狀及病理變化。（2）通過對分離毒株進(jìn)行核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)分離株與犬細(xì)小病毒核苷酸同源性為為99.3 % ~99.4 %，為了進(jìn)一步確定分離的細(xì)小病毒分型，對分離毒株氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，除了101位和297位與CPV-2C一致，其它氨基酸位點(diǎn)均與CPV-2一致，因此確定該分離株為犬細(xì)小病毒CPV-2型，但不排除以后會(huì)向CPV-2C型變異。（3）引起貉病毒性腸炎的細(xì)小病毒比較多，病原致病性也不同，水貂細(xì)小病毒及狐貍細(xì)小病毒對貉致病性不強(qiáng)，危害不嚴(yán)重，近幾年發(fā)生的貉細(xì)小病毒性腸炎對幼貉致病性比較強(qiáng)，發(fā)病率及致死率均比較高，與以往不同，因此有人懷疑出現(xiàn)了變異毒株，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，是犬細(xì)小病毒感染了貉，引起區(qū)域流行。（4）由于缺乏特效的治療方法，目前對于貉細(xì)小病毒性腸炎的免疫預(yù)防主要靠免疫水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗，臨床上采取45 d左右早免疫及間隔14~21 d進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫的方案，可起到很好免疫保護(hù)作用。（5）分離毒為流行強(qiáng)毒株，可為當(dāng)前貉病毒性腸炎的臨床防控提供素材，還可用于貉病毒性腸炎疫苗研發(fā)及現(xiàn)有疫苗應(yīng)用效果的評價(jià)。

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山東省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-21-17）

（2021–01–22）

S852.65+9.2

A

1007-1733（2021）05-0008-03