王 丹，鄭若欣，馬 康，陳 濤，吉 喆，吳衛(wèi)宇，李芳芳，蘭 余，曹曉念，袁 強(qiáng)，張 琴，劉小剛

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.四川國檢檢測有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000）

生物堿是一類廣泛分布于植物界中重要的天然有機(jī)化合物,具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗菌、抗炎、止咳平喘、降血壓、抗心律失常和抗癌等生理活性，也是瑪咖中重要的活性成分之一[1-2]?？偵飰A含量測定常用的方法有雷氏鹽比色法、酸性染料比色法、酸堿滴定法等。雷氏鹽法利用生物堿在酸性條件下與硫氰酸鉻銨反應(yīng)生成不溶于水的生物堿雷氏銨鹽，丙酮溶解后分光光度法測定，但限于檢測季銨型生物堿；酸堿滴定法操作簡便、成本低廉、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，但靈敏度較低；酸性染料比色法是離子對萃取比色法中的一種，與分光光度法相結(jié)合，共同測定總生物堿的含量，靈敏度高、重現(xiàn)性好且操作簡便[3]。該方法已應(yīng)用在《中華人民共和國藥典》[4]第一部中藥材總生物堿的測定。目前瑪咖應(yīng)用于配制酒中形成瑪咖露酒，具有一定的市場規(guī)模，但還未形成瑪咖酒中總生堿含量檢測方法。本試驗建立瑪咖酒中總生物堿檢測方法并對該方法進(jìn)行確認(rèn)，以期為瑪咖酒中總生物堿含量檢測提供準(zhǔn)確有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

瑪咖酒試樣：瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司提供；對照品苦參堿：純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所；其他化學(xué)試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：BS224S型精密電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；S40KpH-電導(dǎo)率-離子綜合測定儀，美國梅特勒；U-3900型紫外可見分光光度計，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制

1.2.1.1 溴甲酚綠緩沖液

精密稱取溴甲酚綠0.050 g，加入3 mL的0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入1.012 g磷酸二氫鉀和適量蒸餾水溶解，用水定容至100 mL，搖勻，用氫氧化鈉調(diào)至pH4.4，即得。

1.2.1.2 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取苦參堿對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷溶解定容，得1 mg/mL苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制：精密吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.2.2 瑪咖酒中總生物堿的提取[5]

取100 mL瑪咖酒試樣于60 ℃水浴揮發(fā)至干，加入10 mL的0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，再置于250 mL分液漏斗中，加入10 mL三氯甲烷，萃取后下層液置于100 mL燒杯中，上層液中加入10 mL正丁醇，萃取后取上層液合并至燒杯中。下層液用濃氨水調(diào)pH9～10后，再次分別加入10 mL三氯甲烷和正丁醇分別提取，合并萃取液。合并的萃取液過濾后于60 ℃水浴濃縮近至10 mL，至10 mL容量瓶中用正丁醇定容，待測。

1.2.3 最大吸收波長的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.8 mL，置于25 mL比色管中，各加入1 mL正丁醇，加三氯甲烷至10 mL，加5 mL去離子水，2 mL溴甲酚綠緩沖液，震蕩萃取后，8000 r/min離心5 min后取下層液于最大吸收波長下測定吸光值。通過380～510 nm波段全掃描，形成吸收波長圖譜，判定最大吸收波長。

1.2.4 試樣的測定

取瑪咖酒試樣的濃縮待測液1 mL于25 mL比色管中，加三氯甲烷至10 mL，后續(xù)按“1.2.3”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出總生物堿質(zhì)量。

1.2.5 方法的正確度試驗

采用陰性樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加入試驗，以平行試驗的均值與加入濃度相比較。本方法采用0.1 mg、0.5 mg、1 mg的加標(biāo)量考察正確度。分別取0.1 mL、0.5 mL、1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于10 mL的50%乙醇溶液中，60 ℃水浴揮發(fā)至干，加入10 mL的0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，用三氯甲烷-正丁醇提取，濃縮至10 mL，后續(xù)按“1.2.3”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定。

1.2.6 方法的精密度試驗

精密稱取瑪咖酒試樣，按照確認(rèn)后的檢測方法在再現(xiàn)性條件下平行測定6次，計算總生物堿含量及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.7 方法的回收率試驗

分別取三組6平行已知總生物堿含量的瑪咖酒試樣50 mL，每組加標(biāo)水平為標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL，60 ℃水浴揮干，加入10 mL 0.5 %鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，用三氯甲烷-正丁醇提取后，濃縮至10 mL，按“1.2.3”項下的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

通過380～510 nm波段掃描，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在416 nm處有最大吸收波長。按照“1.2.3”的方法進(jìn)行試驗，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。如圖1所示，以吸光度為橫坐標(biāo)，苦參堿質(zhì)量濃度（mg）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得到線性回歸方程y=0.1156x+0.0063（R2=0.9954），線性范圍質(zhì)量濃度0～0.18 mg。

圖1 總生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法的正確度試驗

按照“1.2.5”方法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表1。

由表1可知，該方法不同水平加標(biāo)下其均值與加入濃度比較，測定的含量偏差范圍在-8%～6%之間，絕對偏差均小于10%，即滿足重復(fù)性試驗的要求。

表1 正確度驗證結(jié)果

2.3 方法的精密度試驗

按照“1.2.6”的方法進(jìn)行試驗，結(jié)果如表2所示。對總生物堿精密度試驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，可得RSD=3.3%。試驗表明，該方法測定總生物堿含量具有較好的再現(xiàn)性。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.4 方法的回收率試驗

按照“1.2.7”的方法進(jìn)行試驗，結(jié)果如表3所示。由表3可知，2種不同加標(biāo)水平下，加標(biāo)濃度為1 mg/L時回收率在81 %～93 %之間，加標(biāo)濃度為5 mg/L和10 mg/L時回收率在90%～96%之間，回收率穩(wěn)定在同一水平。試驗表明，該方法測定總生物堿含量具有較高的準(zhǔn)確性。

表3 回收率試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本試驗在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上建立了瑪咖酒中總生物堿的檢測方法。經(jīng)驗證，溴甲酚綠酸性法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍質(zhì)量濃度為0～0.18 mg，線性值為0.9954，正確度偏差范圍在-8%～6%之間，方法精密度RSD=3.3 %，不同濃度加標(biāo)水平下回收率穩(wěn)定。由此可以確認(rèn)采用瑪咖酒樣濃縮后0.5%鹽酸溶解，三氯甲烷-正丁醇提取，溴甲酚綠酸性染料顯色的方式比色檢測其總生物堿含量的方法操作簡單，重復(fù)性好，靈敏可靠，可用于瑪咖酒中總生物堿含量的測定。

試驗中還發(fā)現(xiàn)，以下幾方面會影響本法測量的準(zhǔn)確度，需要在測定中特別注意：（1）在萃取時需加入過量的氯化鈉以防止乳化反應(yīng)，若萃取時仍存在乳化則應(yīng)高速離心達(dá)到分層；（2）萃取液濃縮可以選擇水浴鍋或者真空濃縮儀，若選擇真空旋蒸則應(yīng)選擇大容量雞心瓶以避免爆沸；（3）溴甲酚綠顯色時振搖不能太過劇烈，容易形成完全乳化，造成回收率偏低。