盛鳳云，徐俊敏，宋科峰，周嘉琪，陳 雙

（1.無(wú)錫市振太酒業(yè)有限公司，江蘇無(wú)錫 214092；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122）

黃酒是我國(guó)民族特色酒精飲料，伴隨中華文明發(fā)展，是千百年來(lái)深受?chē)?guó)人喜愛(ài)的飲品。黃酒釀造采用獨(dú)特的曲法釀造，邊糖化邊發(fā)酵高濃釀造工藝，賦予了黃酒芳香濃郁，口味醇厚的風(fēng)格特征。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中會(huì)釋放大量的熱量，熱量的聚集會(huì)快速提高發(fā)酵醪液的溫度，從而影響酵母的發(fā)酵活性。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中通常采用“開(kāi)耙”工藝來(lái)控制發(fā)酵醪液的溫度。目前黃酒發(fā)酵最高溫度一般在28～33 ℃之間，屬于常溫發(fā)酵。這一溫度區(qū)間處于酵母的最適生長(zhǎng)發(fā)酵溫度區(qū)間，酵母生長(zhǎng)和代謝十分旺盛，從而能夠快速發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和其他代謝副產(chǎn)物。但發(fā)酵酒精飲料的生產(chǎn)并不同于工業(yè)乙醇的生產(chǎn)，在追求生產(chǎn)效率的同時(shí)還要兼顧產(chǎn)品的品質(zhì)。其中風(fēng)味品質(zhì)是黃酒產(chǎn)品品質(zhì)的重要組成部分。由于黃酒發(fā)酵醪液營(yíng)養(yǎng)豐富，加之采用常溫發(fā)酵工藝，黃酒酵母在快速的生長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)代謝產(chǎn)生大量高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)。高級(jí)醇被認(rèn)為是引起黃酒飲后上頭的重要因素之一[1]。有研究表明酵母在較高的溫度下進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)酵，其代謝產(chǎn)生高級(jí)醇的能力要明顯高于低溫發(fā)酵。溫度是調(diào)控酵母代謝產(chǎn)生高級(jí)醇的重要手段之一[2]。同時(shí)有研究表明，較高的發(fā)酵溫度并不利于酵母胞內(nèi)對(duì)于酯類(lèi)物質(zhì)的代謝生成[3]。為了提高酒精飲料的產(chǎn)品品質(zhì)，采用低溫發(fā)酵工藝是酒精飲料釀造過(guò)程中普遍采用的一種方式。啤酒、日本清酒及白葡萄酒均是采用較低的發(fā)酵溫度，使酵母代謝產(chǎn)生有利的風(fēng)味成分，以提高酒的風(fēng)味品質(zhì)。而目前黃酒釀造過(guò)程中還少有采用低溫發(fā)酵工藝的嘗試。為了降低黃酒中高級(jí)醇的含量和提高黃酒的香氣品質(zhì)，本研究探索了低溫發(fā)酵工藝在黃酒釀造過(guò)程中的可行性和對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種及麥曲

釀酒酵母菌株ZT-1（S.cerevisiae-ZT-1）。酵母菌株經(jīng)YPD斜面培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h后于4 ℃下保存。使用前經(jīng)新鮮YPD斜面培養(yǎng)基于30 ℃下活化24 h后使用。麥曲由無(wú)錫市振太酒業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑

酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、乳酸、氫氧化鈉、亞甲基藍(lán)、二硝基水楊酸（DNS）等試劑均為分析純，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。香氣化合物定量分析所用標(biāo)準(zhǔn)樣品均購(gòu)于上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司，所有化合物純度均＞5%。糯米為企業(yè)黃酒釀造生產(chǎn)原料。頂空固相微萃取用2 cm 50/30 μm固相微萃取頭divinylbenzene/carboxen/poly (dimethylsiloxane) (DVB/CAR/PDMS)購(gòu)于上海Sigma貿(mào)易有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC 6890N-MS 5975)，美國(guó)Agilent公司；德國(guó)Gerstel MPS 2多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，德國(guó)Gerstel公司；生化恒溫培養(yǎng)箱BSP-250，蘇州江東精密儀器有限公司；AB204-E分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；高速冷凍離心機(jī)Avanti J-E，美國(guó)Beckman公司；光學(xué)顯微鏡SZ40，日本奧林巴斯公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與溶液

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸膏10 g/L，瓊脂20 g/L，經(jīng)121 ℃滅菌30 min后制成YPD斜面培養(yǎng)基和YPD平板培養(yǎng)基。

糖液培養(yǎng)基：以大米和麩皮為原料，添加酶制劑進(jìn)行蒸煮、糖化。糖液用紗布?jí)赫ミ^(guò)濾后，調(diào)節(jié)糖液濃度至13 Brix，用乳酸將糖液pH值調(diào)至4.0后制得糖液培養(yǎng)基。糖液培養(yǎng)基經(jīng)108 ℃滅菌20 min后使用。

1.1.5 酵母菌的培養(yǎng)

釀酒酵母種子液制備：挑取一環(huán)經(jīng)新鮮YPD斜面活化后的酵母菌泥接種至5 mL YPD液體試管，將接種后的試管于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后作為酵母種子液使用。

不同溫度條件下酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定：配制新鮮糖液培養(yǎng)基，將糖液培養(yǎng)基采用膜過(guò)濾（0.22 μm濾膜）除菌后分裝至10×18 cm無(wú)菌試管（裝液量5 mL）。準(zhǔn)確吸取同一試管中的種子液（100 μL）至糖液試管。將接種后的糖液試管分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)，每一培養(yǎng)溫度設(shè)置10個(gè)平行樣品。培養(yǎng)過(guò)程中每12 h取不同溫度培養(yǎng)試管（2支）測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。酵母菌體生長(zhǎng)情況以O(shè)D600表示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒釀造試驗(yàn)

工業(yè)小試規(guī)模釀酒試驗(yàn)：參照陳雙等[4]中論述的方法進(jìn)行。首先將酵母菌種于5 mL YPD液體試管中活化培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的YPD種子液接種于500 mL滅過(guò)菌的糖液培養(yǎng)基中（1000 mL三角瓶），將接種后的三角瓶糖液培養(yǎng)基于30 ℃下靜置培養(yǎng)24 h后作為釀酒用種子液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用發(fā)酵小試罐為發(fā)酵容器模擬黃酒發(fā)酵流程。試驗(yàn)過(guò)程中主要設(shè)置兩個(gè)控溫工藝，一是低溫發(fā)酵控溫工藝，該工藝中通過(guò)在發(fā)酵小試罐中的冷卻夾套對(duì)發(fā)酵醪液進(jìn)行降溫，控制整個(gè)發(fā)酵周期醪液中溫度為20 ℃±3 ℃，該發(fā)酵體系標(biāo)記為20 ℃黃酒釀造；二是采用正常發(fā)酵工藝，前發(fā)酵過(guò)程中控制發(fā)酵溫度為30 ℃±3 ℃，完成前發(fā)酵過(guò)程后將發(fā)酵醪液溫度降低至18 ℃進(jìn)行后發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵周期為20 d。完成發(fā)酵過(guò)程后將黃酒發(fā)酵醪液經(jīng)紗布過(guò)濾，濾液以10000 r/min、4 ℃離心后取上清液（黃酒新酒）進(jìn)行分析。

1.2.2 黃酒常規(guī)理化指標(biāo)分析

黃酒理化指標(biāo)分析參照趙光鰲編著的《黃酒生產(chǎn)分析檢驗(yàn)》和黃酒國(guó)標(biāo)GB/T 13662—2018所述方法進(jìn)行。

1.2.3 黃酒樣品風(fēng)味組分分析

（1）酒樣及發(fā)酵液揮發(fā)性組分的提取。酒樣和發(fā)酵液揮發(fā)性組分的提取采用頂空固相微萃取法進(jìn)行，具體方法參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[4]。采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(Supelco,Inc.,Bellefonte,PA)對(duì)黃酒樣品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行萃取。具體操作過(guò)程如下：在20 mL頂空瓶中加入8 mL黃酒樣品，3 g NaCl和5 μL內(nèi)標(biāo)溶液（2-辛醇，70 mg/L）后插入SPME萃取頭。以50 ℃預(yù)熱5 min后進(jìn)行萃取吸附45 min。完成萃取過(guò)程后將萃取頭于GC進(jìn)樣口解吸5 min(250 ℃)，用于GC-MS分析。

（2）GC-MS分析。GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速2 mL/min。不分流進(jìn)樣。樣品采用DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱（60 m × 0.25 mm i.d.,0.25 μm film thickness,Agilent,Torrance,CA）進(jìn)行分離。升溫程序：50 ℃恒溫2 min，以6 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持10 min。

MS條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍30.00～350.00 amu。

（3）定性及定量分析?；衔锏蔫b定首先通過(guò)質(zhì)譜檢索結(jié)果與文獻(xiàn)RI值比對(duì)進(jìn)行初步鑒定；再通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖及RI值比對(duì)進(jìn)行最終的驗(yàn)證。香氣化合物的定量分析采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行，將不同濃度目標(biāo)風(fēng)味化合物配置于模擬黃酒（含5.0 g/L乳酸的15%vol乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH至4.0）分別進(jìn)行相應(yīng)分析。根據(jù)目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度及響應(yīng)比制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算化合物的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酒酵母低溫耐受性研究

為了考察黃酒低溫釀造工藝的可行性，我們首先對(duì)黃酒酵母菌株的低溫耐受性進(jìn)行了研究。比較黃酒酵母在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況（圖1）可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的降低酵母的生長(zhǎng)速率明顯減慢。25 ℃和30 ℃條件下黃酒酵母保持了較快的生長(zhǎng)速度，隨著溫度的降低15 ℃和20 ℃條件下酵母生長(zhǎng)速率降低十分明顯。但比較培養(yǎng)48 h酵母菌體濃度可以看出20 ℃、25 ℃、30 ℃條件下酵母菌體濃度并沒(méi)有顯著的差異，而15 ℃條件下酵母培養(yǎng)48 h仍無(wú)法達(dá)到穩(wěn)定期，這將對(duì)酵母后期的發(fā)酵產(chǎn)生一定的影響。由以上結(jié)果可以看出，黃酒酵母在20 ℃條件下雖然生長(zhǎng)速度受到抑制，但經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng)酵母能夠進(jìn)入穩(wěn)定期，且酵母菌體最大濃度與30 ℃條件下培養(yǎng)基過(guò)并無(wú)顯著的差異。說(shuō)明20 ℃條件可以作為酵母低溫發(fā)酵工藝試驗(yàn)的溫度條件。

2.2 黃酒低溫發(fā)酵過(guò)程研究

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)黃酒酵母生長(zhǎng)溫度耐受性試驗(yàn)結(jié)果可知，黃酒酵母在20 ℃低溫條件下能夠較好的進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證低溫黃酒發(fā)酵工藝的可行性，在工業(yè)條件下進(jìn)行了黃酒模擬發(fā)酵小試驗(yàn)。在發(fā)酵過(guò)程中跟蹤分析酵母數(shù)量的變化過(guò)程如圖2所示。結(jié)果表明，30 ℃發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)迅速，在20 h內(nèi)即達(dá)到最大數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期。但在較高溫度條件下隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行酵母衰老迅速，在發(fā)酵60 h時(shí)醪液中的活酵母數(shù)量開(kāi)始減少，在前發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵醪液中酵母數(shù)量降低到接近2.21×108CFU/mL。常溫發(fā)酵過(guò)程糖化發(fā)酵速率較快，前酵結(jié)束時(shí)醪液中的乙醇含量能夠超過(guò)13 %vol[5]。乙醇是酒精飲料發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞面臨的主要環(huán)境脅迫之一，較高的乙醇濃度會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生極大的傷害，而較高的溫度會(huì)加強(qiáng)乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的破壞作用[6-7]。黃酒常溫釀造過(guò)程中高濃度乙醇的快速積累可能是造成酵母細(xì)胞過(guò)早衰亡的主要原因。

而在20 ℃較低的發(fā)酵溫度條件下酵母前期生長(zhǎng)較為緩慢，經(jīng)過(guò)50 h的生長(zhǎng)醪液中的酵母數(shù)量才達(dá)到最大值。但是在低溫發(fā)酵條件下發(fā)酵醪液中酵母的活力得到了較好的保持，在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)醪液中活酵母的數(shù)量一直維持在3.2×108CFU/mL左右，這一結(jié)果也與前期實(shí)驗(yàn)室酵母低溫生長(zhǎng)過(guò)程數(shù)量變化的趨勢(shì)相一致。

圖3顯示了不同發(fā)酵溫度工藝條件下醪液中還原糖變化過(guò)程。從發(fā)酵醪液中還原糖濃度的變化規(guī)律可以看出，30 ℃環(huán)境是酵母較為適宜的發(fā)酵溫度，酵母耗糖迅速，醪液中還原糖濃度在24 h內(nèi)降低十分明顯，在發(fā)酵6 d時(shí)醪液中還原糖濃度已經(jīng)低于10 g/L。而在20 ℃低溫條件下酵母發(fā)酵速率相對(duì)較低，醪液中殘?zhí)菨舛仍诎l(fā)酵50 h的時(shí)候接近峰值（120 g/L）。但50 h后隨著酵母數(shù)量接近峰值（見(jiàn)圖2），醪液中還原糖濃度開(kāi)始迅速下降。從圖3還可以看出雖然20 ℃條件下酵母發(fā)酵速率相對(duì)降低，但相對(duì)于30 ℃條件時(shí)發(fā)酵速率的峰值差距并不是十分顯著。在發(fā)酵6 d時(shí)醪液中的殘?zhí)菨舛纫呀?jīng)低于10 g/L。這一結(jié)果顯示在較低溫度下酵母仍然能夠較快的利用發(fā)酵體系中的糖分。采用低溫黃酒釀造方式整體發(fā)酵周期并沒(méi)有延長(zhǎng)。

圖3 不同溫度黃酒釀造試驗(yàn)醪液中殘?zhí)菨舛茸兓^(guò)程

進(jìn)一步比較最終釀制黃酒理化指標(biāo)（見(jiàn)表1）可以看出，兩種不同溫度控制條件下釀制的黃酒在酒精、殘?zhí)羌案视秃恐笜?biāo)上并沒(méi)有顯著性差異。但是20 ℃條件下釀制的黃酒pH值和總酸含量要略低于30 ℃條件下釀制的黃酒。這可能是因?yàn)榈蜏貤l件抑制了發(fā)酵體系中產(chǎn)酸雜菌的繁殖。在α-氨基氮含量指標(biāo)上20 ℃條件下釀制的黃酒也低于30 ℃條件下釀制的黃酒。黃酒中氨基酸態(tài)氮主要由原料蛋白質(zhì)的降解及酵母自溶生成[8]。30 ℃發(fā)酵條件下酵母較高的死亡率造成的細(xì)胞自溶可能是最終釀制黃酒中α-氨基氮含量高的主要原因。

表1 不同溫度條件釀造黃酒理化指標(biāo)比較

通過(guò)對(duì)不同溫度控制工藝條件下黃酒釀造過(guò)程的跟蹤及理化指標(biāo)分析結(jié)果可以看出，在較低的發(fā)酵溫度條件下雖然初始發(fā)酵速率降低，但總的發(fā)酵時(shí)間和最終釀造黃酒理化指標(biāo)與常溫發(fā)酵工藝并無(wú)顯著的差異，說(shuō)明在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中采用低溫黃酒釀造工藝是完全可行的。

2.3 低溫發(fā)酵工藝對(duì)黃酒揮發(fā)性香氣特征影響研究

低溫釀造是啤酒、日本清酒及白葡萄酒釀造過(guò)程中提高風(fēng)味品質(zhì)的重要工藝措施[9-10]，但低溫黃酒釀造對(duì)黃酒風(fēng)味品質(zhì)的影響目前還沒(méi)有相關(guān)的研究。本研究在工業(yè)小試規(guī)模順利完成低溫黃酒釀造工藝的基礎(chǔ)上對(duì)釀制黃酒風(fēng)味特征進(jìn)行了深入的研究。從風(fēng)味分析結(jié)果（表2，圖4）可以看出，低溫發(fā)酵對(duì)黃酒中高級(jí)醇的含量產(chǎn)生了明顯的影響。比較20 ℃和30 ℃條件釀制黃酒高級(jí)醇含量可以看出，20 ℃條件釀制的黃酒總高級(jí)醇含量要顯著低于30 ℃條件釀制的黃酒。采用低溫發(fā)酵工藝釀造的黃酒總高級(jí)醇含量降低了22%。高級(jí)醇被認(rèn)為是引起黃酒飲后上頭的主要原因之一[1]，本研究證明通過(guò)低溫釀造工藝的應(yīng)用能夠有效的降低黃酒中高級(jí)醇的含量，從而提高黃酒的飲用舒適度。圖4結(jié)果顯示，低溫釀造工藝對(duì)黃酒中重要風(fēng)味物質(zhì)β-苯乙醇的含量并沒(méi)有造成影響。20 ℃和30 ℃條件釀制的黃酒中β-苯乙醇的含量并沒(méi)有顯著的差異。

圖4 不同發(fā)酵溫度釀制黃酒高級(jí)醇含量比較（總高級(jí)醇不包含β-苯乙醇）

表2 不同發(fā)酵溫度工藝條件下釀制黃酒香氣成分比較

酯類(lèi)物質(zhì)作為酒精飲料重要的有益風(fēng)味物質(zhì)一直是釀酒科學(xué)研究的重點(diǎn)。圖5結(jié)果顯示，低溫釀造工藝生產(chǎn)的黃酒中乙酸乙酯含量和總酯含量均要高于常溫釀造工藝的黃酒。酯類(lèi)化合物由于其較低的香氣閾值和愉悅的水果香、花香的香氣特征是黃酒風(fēng)味成分中最主要也是最重要的一類(lèi)化合物[4]。較高的酯類(lèi)物質(zhì)含量能夠提高黃酒酯香的香氣特征。這一結(jié)果也得到感官分析的驗(yàn)證，通過(guò)感官分析比較兩種工藝釀制的黃酒發(fā)現(xiàn)，采用低溫發(fā)酵工藝釀制的黃酒果香、花香的香氣特征要明顯優(yōu)于常溫發(fā)酵工藝釀制的黃酒。

圖5 不同發(fā)酵溫度釀制黃酒酯類(lèi)物質(zhì)含量比較（總酯含量不包含乙酸乙酯）

3 結(jié)論

通過(guò)比較黃酒酵母在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況確認(rèn)了黃酒低溫釀造的可行性及適宜的低溫工藝條件。試驗(yàn)中開(kāi)發(fā)出的黃酒低溫釀造工藝相對(duì)于常溫釀造過(guò)程發(fā)酵時(shí)間并沒(méi)有增加。低溫發(fā)酵釀制的黃酒主要理化指標(biāo)也保持了黃酒的特征。通過(guò)低溫釀造工藝的運(yùn)用，所釀制的黃酒香氣特征較常溫釀制黃酒有了顯著的提升。低溫釀制的黃酒中總高級(jí)醇含量要顯著低于常溫釀制的黃酒，能夠有效減少黃酒飲后上頭的影響。同時(shí)低溫釀制黃酒整體香氣品質(zhì)特別是水果香花香的香氣特征要顯著優(yōu)于常溫釀制黃酒。通過(guò)本研究結(jié)果說(shuō)明，黃酒釀造過(guò)程低溫釀造工藝完全可行，且通過(guò)低溫黃酒釀造能夠有效提高黃酒產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。