高 新 陳啟杰 趙雅蘭 胡志強(qiáng) 王建輝

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院;湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，長沙 410004)

淀粉是僅次于纖維素的第二大可再生資源，淀粉納米晶(SNCs)是從天然淀粉中采用物理、化學(xué)或生物法制得的一種納米尺寸的聚多糖晶體[1]，具有來源廣、粒徑小、熱穩(wěn)定性好、比表面積大、可生物降解等特點(diǎn)，可用作食品乳液穩(wěn)定劑[2]、食品分離膜[3]，及納米復(fù)合膜增強(qiáng)[4]、藥物載體[5]等領(lǐng)域的應(yīng)用。

酸水解法制備淀粉納米晶主要包括兩個階段：第一階段是較快的酸水解階段，主要是淀粉顆粒中非晶態(tài)部分的水解，第二階段是緩慢水解階段，主要是與淀粉中結(jié)晶部分緩慢降解有關(guān)[6]。酸水解法制備淀粉納米晶保留淀粉顆粒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，大部分的淀粉無定型區(qū)被水解掉，得率較低，且反應(yīng)時間長[7]，Putaux等[8]將糯玉米淀粉和鹽酸混合，35 ℃反應(yīng)6周制備淀粉納米晶，淀粉顆粒尺寸為20～40 nm，得率僅為0.5%；Kim等[9]用不同來源、不同直鏈含量的淀粉為原料，在40 ℃硫酸水解淀粉7 d，顆粒尺寸40～70 nm，不同來源的淀粉對SNCs的制備影響較大；Angellier等[10]用14.69%糯玉米淀粉溶液和硫酸(3.16 mol/L)在40 ℃下，水解反應(yīng)5 d，淀粉納米晶的粒徑100 nm，產(chǎn)率僅有15%左右。

生物酶處理是采用酶作用于淀粉顆粒表面以及內(nèi)部較易水解的非結(jié)晶區(qū)，使淀粉的非還原末端逐漸水解，改變淀粉的黏度和聚合度(DP)。生物酶可以使淀粉顆粒破碎，H+更容易進(jìn)入顆粒內(nèi)部，使非結(jié)晶區(qū)水解更徹底，且綠色環(huán)保。Kim等[11]采用純酶對糯米淀粉進(jìn)行水解，表明淀粉顆粒中的非晶區(qū)可以通過α-淀粉酶選擇性地去除；LeCorre等[12]研究α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化酶制備SNCs，糖化酶對糯玉米淀粉水解6 h后，能達(dá)到正常酸水解24 h的效果。糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，同α-淀粉酶、β-淀粉酶相比，糖化酶能有效的破壞淀粉顆粒表面的形貌；糯玉米淀粉中支鏈淀粉達(dá)到95%以上，是一類多聚糖類物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。本研究采用糖化酶預(yù)處理糯玉米原淀粉，酶解原淀粉顆粒的部分無定形區(qū)，結(jié)合硫酸水解法處理制備糯玉米淀粉納米晶，探討糯玉米淀粉納米晶的制備工藝，并對糯玉米淀粉納米晶進(jìn)行表征，為其工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糯玉米淀粉、糖化酶(20 000 U/mL)；檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硫酸均為分析純。

1.2 主要儀器

D/MAX2200X X射線衍射儀，Zetasizer Nano ZS 激光粒度分析儀，Vertex傅里葉變換紅外光譜儀，Quanta 250 FEG掃描電子顯微鏡，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)，TG16-WS臺式高速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 淀粉納米晶的制備

1.3.1.1 生物酶預(yù)處理

稱取一定量的糯玉米原淀粉，置于盛有150 mL、pH=4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的三口燒瓶中，加入一定量的糖化酶溶液，然后將三口燒瓶置于60 ℃的水浴鍋中，以200 r/min速度機(jī)械攪拌，反應(yīng)2 h，待反應(yīng)結(jié)束后，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH，直至pH>7，停止酶解。將其置于12 000 r/min的高速離心機(jī)中離心10 min，將得到的沉淀物置于35 ℃的烘箱中烘干后備用。

1.3.1.2 酸水解

酸水解工藝是將酶預(yù)處理的淀粉制備成淀粉納米晶。稱取一定量的酶預(yù)處理的淀粉，置于盛有250 mL、3.16 mol/L的硫酸的三口燒瓶中，然后將三口燒瓶置于40 ℃的水浴鍋中，以200 r/min速度機(jī)械攪拌，反應(yīng)一段時間。待反應(yīng)結(jié)束，以12 000r/min的速度將產(chǎn)物進(jìn)行離心，然后用蒸餾水洗滌，重復(fù)多次直至離心后的上清液pH恒定，最后將所得固體進(jìn)行真空冷凍干燥，得到SNCs。

1.3.2 X射線衍射儀(XRD)分析

用X射線衍射儀測定。測試條件為管壓30 kV，管流30 mA，掃描速度為1(°)/min，掃描區(qū)域?yàn)?0°～40°接受狹縫0.3 mm。通過MDI jade 6.5計(jì)算相對結(jié)晶度。

1.3.3 粒徑和Zeta電位測量

用激光粒度分析儀對樣品進(jìn)行粒徑分布和Zeta電位測量，用0.1mol/L的NaOH將混合溶液的pH值調(diào)整到7.0，再加入蒸餾水將樣品配制成0.01%的懸浮液，在超聲分散器下處理10 min后再測定其粒徑分布和Zeta電位。

1.3.4 淀粉納米晶產(chǎn)率的計(jì)算

采用電子天平稱量冷凍干燥后的淀粉納米晶的質(zhì)量，其產(chǎn)率的計(jì)算公式如下：

Y=m1/m×100%

式中：m1為冷凍干燥后淀粉納米晶的質(zhì)量/g，m為糯玉米原淀粉的絕干質(zhì)量/g，Y為淀粉納米晶的產(chǎn)率/%。

1.3.5 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析

釆用KBr壓片法，將樣品按比例1%與KBr充分混合，混合物在研缽中研磨，隨后將其放置在壓膜器中壓片，樣品薄片于紅外光譜儀(Vertex70 v，德國)上測試，掃描范圍從4 000 cm-1到4 00 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.3.6 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察，將樣品研成粉末，取0.1 mg樣品粘在導(dǎo)電膠上，對樣品進(jìn)行噴金，之后將樣品置于干燥器中加速電壓為30 kV，觀察并拍攝具有代表性的顆粒形貌。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，利用Origin8.0軟件對平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析，采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在95%置信水平上估計(jì)平均值之間的顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 XRD分析

糯玉米原淀粉和不同酶用量的酶預(yù)處理淀粉的XRD如圖1所示，糯玉米原淀粉和酶預(yù)處理淀粉的X射線衍射峰型相同，2θ在15°、17°、18°、23.5°附近出現(xiàn)了明顯的衍射峰，說明糯玉米原淀粉經(jīng)過糖化酶處理后沒有改變其結(jié)晶結(jié)構(gòu)，仍保持典型的A晶型[13]。糯玉米原淀粉的相對結(jié)晶度(RC)是33.99%，當(dāng)糖化酶的用量為500、1 000、1 500、2 000 U/g時，酶預(yù)處理淀粉的RC分別為33.18%、32.26%、27.76%、24.66%。隨著糖化酶用量的增加，淀粉的RC逐漸降低，當(dāng)糖化酶的用量為1 500 U/g時，其RC下降了6.73%，表明此時淀粉的晶體結(jié)構(gòu)被酶破壞的較嚴(yán)重，不利于后續(xù)采用酸水解制備淀粉納米晶[14]。因此，對淀粉顆粒造成更高程度損傷的同時盡可能保護(hù)結(jié)晶結(jié)構(gòu)，選擇糖化酶用量為1 000 U/g制備的酶預(yù)處理淀粉作為后續(xù)酸水解處理的淀粉。

注：a 糯玉米原淀粉，b-e依次為500，1 000、1 500、2 000U/g淀粉。 圖1 淀粉X射線衍射圖

2.2 粒徑分析

糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶預(yù)處理糯玉米淀粉分別酸水解1～5 d制備的SNCs的粒徑分布如圖2所示。糯玉米原淀粉的粒徑集中在10 μm左右，1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉的粒徑集中在5 μm左右，表明糖化酶預(yù)處理淀粉使淀粉顆粒明顯變小，這是因?yàn)樵诿杆膺^程中，糖化酶分子首先攻擊淀粉顆粒比較疏松的無定型區(qū)，從而導(dǎo)致粒徑減小。糯玉米原淀粉酸水解粒徑分布曲線，隨著水解時間的延長，都明顯向左移動，酶預(yù)處理淀粉酸水解的粒徑分布曲線也都明顯向左移動，表明隨著水解天數(shù)的增加，制備的納米晶粒徑越來越小。糯玉米原淀粉酸水解5 d制備的SNCs粒徑分布在100～200 nm，而酶預(yù)處理后的淀粉酸水解5 d的SNCs粒徑分布在50～100 nm。同時，由圖2可以看出1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉水解2 d的SNCs粒徑分布在80～200 nm，和糯玉米原淀粉酸水解5 d的SNCs的粒徑分布相似，表明酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d就可以達(dá)到原淀粉單純酸水解5 d制備的SNCs的效果。

圖2 酸水解制備的SNCs粒徑分布

2.3 產(chǎn)率分析

糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉酸水解1～5 d的產(chǎn)物SNCs的平均粒徑和產(chǎn)率如表1所示。由表可以看出，隨著酸水解時間的增加，糯玉米原淀粉酸水解制備SNCs的粒徑越來越小，產(chǎn)率越來越低。1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉酸水解制備SNCs的粒徑也隨著酸水解時間的增加，粒徑越來越小，產(chǎn)率越來越低，但酶預(yù)處理淀粉制備SNCs產(chǎn)率降低的速率比糯玉米原淀粉制備SNCs的速率要慢，這可能是因?yàn)槊割A(yù)處理淀粉的非結(jié)晶區(qū)已經(jīng)被充分水解，剩下淀粉的結(jié)晶區(qū)比較緊湊，不易被水解。糯玉米原淀粉酸水解5 d的SNCs的平均粒徑為(113.2±6.1) nm，其產(chǎn)率為(14.1±1.7)%。而酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d SNCs的平均粒徑就達(dá)到(112.1±8.9)nm，其產(chǎn)率為(24.1±1.6)%，產(chǎn)率較糯玉米原淀粉水解法提高了70.9%，酶預(yù)處理淀粉酸水解5 d的SNCs的平均粒徑為(50.7±4.2)nm，遠(yuǎn)小于糯玉米原淀粉水解5 d制備的SNCs(113.2±6.1) nm。采用酶預(yù)處理和酸水解相結(jié)合制備SNCs，縮短了反應(yīng)時間且提高了SNCs的產(chǎn)率。

表1 SNCs的粒徑和產(chǎn)率

2.4 Zeta電位分析

圖3是糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉酸水解1～5 d得到SNCs的Zeta電位值。由圖可以看出，SNCs的Zeta電位均為負(fù)值，表明SNCs的表面帶負(fù)電荷，這和Angellier[15]報道結(jié)果一致。糯玉米原淀粉隨著酸水解天數(shù)的增加，SNCs 的Zeta電位的絕對值明顯增加，1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉也隨酸水解天數(shù)的增加，水解產(chǎn)物SNCs 的Zeta電位的絕對值明顯增加。Zeta電位是用來表示膠體溶液的穩(wěn)定性，衡量顆粒之間排斥力和吸引力的大小，即Zeta電位絕對值越高，溶液的穩(wěn)定性越好[16]。糯玉米原淀粉水解5 d制備的SNCs的Zeta電位絕對值為16.2 mV，與酶預(yù)處理淀粉水解2 d的SNCs的Zeta電位的絕對值16 mV相近，酶預(yù)處理淀粉水解3、4、5 d的SNCs的Zeta電位的絕對值分別為18.1、20.3、22.3 mV，都大于糯玉米原淀粉水解5 d的SNCs 的Zeta電位的絕對值，表明采用糖化酶預(yù)處理和酸水解制備的SNCs的穩(wěn)定性提高，酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d產(chǎn)物的分散體系就能達(dá)到糯玉米淀粉單純酸水解5 d產(chǎn)物分散體系的穩(wěn)定性。

圖3 糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉酸水解1～5 d的淀粉納米晶Zeta電位值

2.5 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析

圖4是糯玉米原淀粉、1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉和酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d SNCs的FT-IR圖。由圖4可以看出，糯玉米原淀粉、酶解淀粉和SNCs的圖譜相似，表明它們的結(jié)構(gòu)基本相似。糯玉米淀粉、酶解淀粉和SNCs在3 468 cm-1處有一個很寬的吸收峰，這可能是葡萄糖單元中O—H基團(tuán)的伸縮振動；在2 971 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰可能是C—H基團(tuán)在葡萄糖單元上的收縮振動；1 650 cm-1附近的吸收峰可能是由淀粉中殘留結(jié)合水中的O—H拉伸振動引起的[17]；以1 452 cm-1為中心的吸收峰可能是由芐基環(huán)骨干伸縮振動引起的[18]。在指紋區(qū)，1 156 cm-1附近的吸收峰是C—O—C基團(tuán)的O—C拉伸振動[19]，1 083 cm-1處波段的吸光度歸因于C—O伸縮振動和C—C骨架振動的復(fù)合性能。在1 020 cm-1附近的吸收峰是淀粉非晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，對應(yīng)于淀粉狀態(tài)結(jié)構(gòu)中的有序結(jié)構(gòu)，989 cm-1附近的特征峰主要是由C—O的彎曲振動引起的，對應(yīng)于淀粉大分子羥基之間形成的氫鍵結(jié)構(gòu)。而SNCs在1 650 cm-1處的吸收峰略有下降，可能是由于淀粉結(jié)構(gòu)中的結(jié)合水被去除，導(dǎo)致O—H彎曲振動降低了SNCs的強(qiáng)度[20]。與在1 020 cm-1處的吸收峰相比，SNCs的強(qiáng)度略微增加，可能是因?yàn)榉蔷^(qū)被水解，與其他樣品在1 104 cm-1處相比，SNCs的吸收峰強(qiáng)度輕微增加，可能是由于淀粉納米晶表面吸附了少量的硫酸根。

注：a 糯玉米原淀粉；b 1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉和；c 酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d的SNCs。圖4 淀粉和SNCs的FT-IR

2.6 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

圖5是糯玉米原淀粉、1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉和酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d的SNCs的SEM，由圖5可以看出，糯玉米原淀粉的顆粒形狀大多數(shù)都是圓形或是橢圓形，結(jié)構(gòu)緊湊、致密，且顆粒表面相對光滑。經(jīng)過糖化酶處理后的酶預(yù)處理淀粉的顆粒多數(shù)呈現(xiàn)為圓形或是橢圓形，顆粒表面出現(xiàn)孔隙、凹陷、孔洞，但還能保持完整顆粒形狀，酶解淀粉表面的裂紋、孔洞和凹陷，使H+更容易進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部，促進(jìn)酸在淀粉顆粒中的擴(kuò)散，使非晶區(qū)更容易水解，縮短了制備SNCs的時間[21]。酶預(yù)處理及酸水解制備的SNCs的顆粒多數(shù)呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，表面有裂紋但仍能保持完整的形狀。

注：a 糯玉米原淀粉；b 1 000 U/g酶預(yù)處理淀粉；c 酶預(yù)處理淀粉酸水解2 d的SNCs。圖5 淀粉和SNCs的SEM

3 結(jié)論

采用XRD研究糖化酶預(yù)處理對糯玉米淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)變化，1 000 U/g糖化酶對糯玉米原淀粉進(jìn)行酶預(yù)處理，部分水解淀粉的無定型區(qū)和結(jié)晶區(qū)，再結(jié)合硫酸水解2 d，制備得到粒徑約100 nm、Zeta電位達(dá)-22.3 mV、產(chǎn)率為24.1%的糯玉米淀粉納米晶。同僅采用酸水解相比，酶預(yù)處理結(jié)合酸水解制備淀粉納米晶使反應(yīng)時間縮短了3 d，SNCs產(chǎn)率增加了70.9%，為糯玉米淀粉納米晶的制備提供了新途徑，且更綠色環(huán)保。