宋澤萱，紀(jì)順師，王 艷，王怡倩，毛 盼，李玲玲，葉長蕓

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種革蘭陽性、兼性厭氧、胞內(nèi)寄生并在環(huán)境中廣泛存在的食源性條件致病菌[1]。人感染可以引起敗血癥、腦膜炎及孕婦流產(chǎn)、死胎等侵襲性疾病，特別是老年人、兒童、孕婦和免疫缺陷患者等高危人群易感[2]。單增李斯特菌廣泛存在于多種食物當(dāng)中，如生肉、即食食物、牛奶、蔬菜、冰淇淋和水產(chǎn)品等，具有較大的人群健康風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。我國目前報(bào)道的單增李斯特菌所致的臨床病例呈散發(fā)存在[6-7]，Li W等報(bào)道2013-2017年從我國64家哨點(diǎn)醫(yī)院共監(jiān)測到211例李斯特菌病例[8]。

單增李斯特菌分為4個(gè)家系和14個(gè)血清型，大多數(shù)菌株屬于家系Ⅰ(包括4b、1/2b、3b、4d、4e和7血清型菌株)和家系Ⅱ(包括1/2a、1/2c、3a、3c和4h血清型菌株)，只有少數(shù)菌株屬于家系Ⅲ和家系Ⅳ(包括4a、4c和4b血清型菌株)[1,9]。食品和臨床分離菌株的主要血清型為1/2a、1/2b、1/2c和4b型，而大多數(shù)李斯特菌病的暴發(fā)與4b血清型相關(guān)[9]。根據(jù)多位點(diǎn)序列分型可將單增李斯特菌分為不同的序列型(sequence types, STs)，僅相差一個(gè)等位基因的序列型歸為同一克隆群(clonal complexes, CCs)。大量單增李斯特菌流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不同型別菌株在病人和食品中的分布有所差異，這種現(xiàn)象可能與菌株攜帶的毒力和環(huán)境抗性基因不同有關(guān)[10]。一些克隆群菌株攜帶高毒力的基因，如毒力島(Listeria pathogenicity island，LIPI)LIPI-3和LIPI-4[11-12]，而一些克隆群菌株攜帶環(huán)境抗性基因，如壓力生存島1(stress survival islet 1，SSI-1)[13]，李斯特菌基因組島(Listeria Genomic Island，LGI)LGI1和LGI2[14-15]。

李斯特菌病的人群發(fā)病率相對較低，但其病死率可達(dá)20%～30%，近年來我國李斯特菌病例報(bào)道逐漸增多[8]。該病潛伏期較長、早期臨床癥狀不典型[2,16]，給臨床李斯特菌病的早期確診帶來一定難度。我國市場零售食品中單增李斯特菌的污染率相對較高并存在持續(xù)污染情況[17]，對公眾健康具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，我國單增李斯特菌在食品和臨床樣本中的型別分布具有相似性，但ST優(yōu)勢型別有明顯差異。食品菌株的ST優(yōu)勢型別為ST9、ST8和ST87型[3,17-18]，不同地區(qū)分離的臨床菌株型別具有一定差異[8,18-21]，ST87型是我國臨床菌株中最常見的型別[22]。目前部分菌株已有基因組信息，但針對我國不同來源菌株基因組特征的深入比較分析尚未見報(bào)道。

因此，本研究對目前NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的146株中國單增李斯特菌基因組進(jìn)行比較分析，根據(jù)菌株的基因組特征，分析不同家系和克隆群菌株之間的種群特點(diǎn)及遺傳特征的差異，為了解我國單增李斯特菌不同型別菌株的傳播特點(diǎn)和致病能力提供參考信息，進(jìn)而為我國李斯特菌病的預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1菌株選擇 根據(jù)目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道[12, 20-21, 23-24]，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中下載來源于中國不同省份(浙江、上海、廣東、江蘇、北京、四川、云南、新疆和河北)的146株單增李斯特菌的基因組(表1)，其中食品、臨床、動物、環(huán)境樣本來源的菌株分別為74株、31株、30株和8株，有3株樣本信息不詳。

表1 本研究用于基因組分析的146株單增李斯特菌信息

1.2全基因組分析 使用Prokka(v1.14.6)軟件對所有菌株的基因組進(jìn)行基因功能注釋。使用軟件Roary(v3.13.0)對146株單增李斯特菌的基因組進(jìn)行泛基因(pan gene)和核心基因(core gene)分析，鑒定菌株中core-pan 基因的數(shù)量比例。使用軟件FastTree對核心基因(core gene)采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3血清型鑒定 通過本地BLASTN軟件鑒定單增李斯特菌血清型分型基因(lmo0737、lmo1118、ORF2819、ORF2110、prs、LMxysn_1095、lmo1083和smcL)，根據(jù)菌株攜帶的不同基因組合情況判定菌株的血清型[1, 25]。

1.4MLST型別分析 使用本地mlst軟件(Seemann T，mlst)，根據(jù)7個(gè)管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA)的位點(diǎn)序列，對所有菌株進(jìn)行ST型別鑒定。CCs克隆群的鑒定通過與巴斯德數(shù)據(jù)庫(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)進(jìn)行比對后確定。

1.5質(zhì)粒的預(yù)測 使用本地軟件ABRicate(v1.0.0)，將所有菌株的基因組與plasmidfinder數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找比對，根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白編碼基因repA的有無鑒定質(zhì)粒是否存在[26]。

1.6毒力基因分析 通過在線毒力基因查找軟件VirulenceFinder2.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)對所有基因組中已知的106個(gè)毒力基因進(jìn)行分析鑒定(序列一致性>85%，序列覆蓋度>80%)，其中已知毒力基因參考序列均來源于EGD-e菌株(NC_003210.1)。使用軟件Diamond(v0.9.32)對參考菌株EGD-e(NC_003210.1)的內(nèi)化素蛋白A(InlA)全長氨基酸(800 aa)建立本地?cái)?shù)據(jù)庫，使用BLASTX軟件將所有基因組序列與本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對序列中若出現(xiàn)*，則表示該基因組中InlA蛋白發(fā)生了提前終止(premature stop codon，PMSC)。

1.7抗性相關(guān)基因組島分析 將壓力生存島SSI-1(NC_003210.1)、SSI-2(HG813249.1)、李斯特菌基因組島LGI1(CP001602.1)和LGI2(NZ_CM001159.1)基因序列分別與全部菌株基因組進(jìn)行比對。以上基因組島均使用本地BLASTN軟件進(jìn)行分析鑒定，要求滿足核酸序列一致性和序列覆蓋度均≥85%。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，分析家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株中質(zhì)粒和壓力生存島SSI-1的攜帶情況。采用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株中質(zhì)粒和壓力生存島的攜帶率差異采用卡方檢驗(yàn)(χ2檢驗(yàn))。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1菌株家系和血清型 本研究中，146株單增李斯特菌共分為3個(gè)家系(家系Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)和6種血清型(1/2b、4b、1/2a、1/2c、4h和4a/4c)(圖1)。家系Ⅰ和Ⅱ菌株來源多樣(食品、臨床和環(huán)境)，而家系Ⅲ菌株中除1株來源不詳外，其余均來源于動物。不同家系菌株血清型具有差異，家系Ⅰ菌株為1/2b 和4b血清型，而家系Ⅱ菌株為1/2a、1/2c、4h血清型，家系Ⅲ菌株為4a/4c血清型。

2.2ST型別和CC克隆群 本研究中單增李斯特菌型別多樣，包括27個(gè)ST型別和20個(gè)CC克隆群(圖1)。不同來源(食品、臨床、動物和環(huán)境)菌株均由多種克隆群組成，其中食品、臨床和動物菌株的優(yōu)勢克隆群分別為CC9、CC87和CC2，優(yōu)勢ST型別分別為ST9、ST87和ST145。

2.3基因組特征 146株單增李斯特菌的泛基因(pan gene)共有8 538個(gè)基因，核心基因(core gene)有1 926個(gè)基因。基于核心基因(core gene)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)相同血清型和克隆群的菌株聚集在一起，菌株之間無明顯的地域和來源(食品、臨床、動物和環(huán)境)聚集性(圖1)。

菌株家系、血清型、克隆群、ST型別、分離省份、分離時(shí)間依次從內(nèi)向外進(jìn)行標(biāo)注，菌株來源、血清型、菌株家系和攜帶的可移動元件的顏色標(biāo)注見右側(cè)圖例說明。

2.4質(zhì)粒攜帶情況 65株(44.5%，65/146)單增李斯特菌攜帶有質(zhì)粒(圖1)，其中家系Ⅱ菌株的質(zhì)粒攜帶率(71.4%，45/63)高于家系Ⅰ菌株(26.3%，20/76)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.1，P<0.01)(表2)。不同ST型菌株的質(zhì)粒攜帶率有所差異，家系Ⅱ中ST155、ST9和ST8型菌株的質(zhì)粒攜帶率較高，分別為100.0%(13/13)、75.0%(12/16)和69.2%(9/13)。

表2 家系Ⅰ和家系Ⅱ菌株的質(zhì)粒和壓力生存島(SSI-1)攜帶情況

2.5毒力基因攜帶情況 本研究中單增李斯特菌均攜帶毒力島LIPI-1，其中全部CC3菌株(100.0%，10/10)和部分CC1菌株(80.0%，4/5)均攜帶毒力島LIPI-3，全部CC87菌株(100.0%，31/31)均攜帶毒力島LIPI-4。在其他已知的74個(gè)毒力基因中，有70個(gè)毒力基因的攜帶率較高(81.5%～100%)，而inlJ(63.0%，92/146)、ami(43.2%，63/146)、inlF(38.4%，56/146)和lisk(19.9%，29/146)4個(gè)基因的攜帶率相對較低。其中家系Ⅰ菌株不攜帶inlF和lisk基因，家系Ⅲ菌株不攜帶inlC、inlF、ami、lapB、aut、lisR和gtcA基因(圖2)。值得注意的是，家系Ⅱ中1株ST626型菌株攜帶毒力島LIPI-1和LIPI-2部分片段，還包括一些非連續(xù)的伊氏李斯特菌的染色體片段，Yin Y等詳細(xì)分析了該菌的高毒力的特點(diǎn)[27]。18株菌的內(nèi)化素蛋白A(Internalin A，InlA)發(fā)生了提前終止(PMSC)，食品菌株(21.6%，16/74)中InlA蛋白的提前終止率高于病人菌株(3.2%，1/31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.4，P<0.05)。

基因的存在和不存在分別用藍(lán)色和灰色表示，顏色的深度表示Identity值的大小。

2.6環(huán)境抗性基因攜帶情況 本研究82.5%(52/63)的家系Ⅱ菌株和22.4%(17/76)的家系Ⅰ菌株攜帶壓力生存島SSI-1，攜帶率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=49.9，P<0.01)(表2)。僅有1株ST121(家系II)菌株攜帶SSI-2。本研究未發(fā)現(xiàn)我國菌株中攜帶抗季胺類消毒劑基因的LGI1。2株CC1、19株CC2和3株CC14菌株均攜帶LGI2，該基因組島含有抗砷(arsD1A1R1D2R2A2B1B2)和抗鎘(cadA4C4)基因。另外，75.0%(15/20)的CC9菌株含有Tn554類似轉(zhuǎn)座子，攜帶砷抗性基因簇(arsCBADR)(圖1)。

3 討 論

單增李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，目前報(bào)道的李斯特菌病大多通過食源性傳播[19]，而李斯特菌病潛伏期較長，給被污染食品的溯源和食品安全監(jiān)管帶來一定困難。全基因組序列分析(WGS)已成為病原溯源調(diào)查和分析遺傳多樣性的重要方法。本研究對我國146株單增李斯特菌的全基因組進(jìn)行了比較分析，描述了菌株的多樣性、特異性及相關(guān)性。

本研究中相同家系、血清型和克隆群的單增李斯特菌在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上聚在一起，這種分布與菌株的來源和分離省份無關(guān)，提示單增李斯特菌基因組結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性。同時(shí)不同省份和分離時(shí)間的菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上交叉分布，可能與單增李斯特菌污染的食品在我國不同省份間的流通有關(guān)。

研究顯示大多數(shù)李斯特菌病的暴發(fā)與家系Ⅰ菌株有關(guān)，相比于家系Ⅱ菌株，家系Ⅰ菌株在臨床分離菌中所占的比例高[9,28]，這可能與部分家系Ⅰ菌株攜帶的毒力島LIPI-3和LIPI-4導(dǎo)致菌株毒力增強(qiáng)有關(guān)[11,29]。此外，由inlA基因編碼的InlA蛋白通過與宿主上皮細(xì)胞的E-鈣黏素結(jié)合，使單增李斯特菌可穿過腸道屏障引起侵襲性感染[30]。研究發(fā)現(xiàn)部分菌株中inlA基因會發(fā)生PMSC突變，截?cái)嗟腎nlA蛋白的功能下降或失活[31]。部分食品菌株的inlA基因發(fā)生了PMSC突變，可能導(dǎo)致其毒力減弱。

質(zhì)粒有助于其宿主菌在不利環(huán)境下生存繁殖，如ST8型菌株攜帶的質(zhì)粒pLMR479a有助于增強(qiáng)菌株對高溫、高鹽、酸性環(huán)境和消毒劑的耐受[32]。壓力生存島SSI-1有助于菌株在低pH和高鹽濃度等不良條件下生存[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，71.43%和82.54%的家系Ⅱ菌株分別攜帶質(zhì)粒和SSI-1，可以提高菌株的環(huán)境適應(yīng)力。此外，許多與環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的基因廣泛存在于家系Ⅱ菌株中[33]，如熱應(yīng)激相關(guān)的基因sigC、lmo0421和lstR僅存在于家系Ⅱ和家系Ⅲ菌株中[34]。ST9型(家系Ⅱ)菌株中攜帶類似Tn554轉(zhuǎn)座子的抗砷基因簇可能有助于ST9型菌株在食品中的生長繁殖，其具體功能需進(jìn)一步研究證實(shí)。因此，大部分家系Ⅱ菌株可能具有更好的環(huán)境適應(yīng)性能力，從而有助于其在食品和環(huán)境中的生長繁殖。

CC9型是我國食品分離菌株的優(yōu)勢型別，這與其他國家的報(bào)道一致，可能與其攜帶的質(zhì)粒和環(huán)境抗性基因有關(guān)[10]。CC87型菌株是我國李斯特菌感染病例中分離菌株的常見菌型[12]，這可能與其攜帶的毒力島LIPI-4有關(guān)，該毒力島有助于單增李斯特菌穿過人的胎盤和血腦屏障，增加單增李斯特菌的感染性[29]。國外臨床菌株的優(yōu)勢克隆群CC1、CC2和CC3型菌株同樣也在我國散發(fā)的李斯特菌病病例中出現(xiàn)[29]。此外，其他克隆群CC5、CC7、CC8、CC9、CC14、CC29、CC89、CC155、CC429的菌株在我國臨床病例中均有出現(xiàn)，說明不同型別單增李斯特菌對人群健康都具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，也顯示對我國食品和臨床病例進(jìn)行單增李斯特菌的病原學(xué)監(jiān)測及分子流行病學(xué)特征分析的重要性。

據(jù)報(bào)道，攜帶抗砷和抗鎘基因的LGI2存在于CC1、CC2和CC4型菌株中，特別是4b血清型菌株，可能有助于提高菌株的毒力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，我國浙江省、云南省和新疆地區(qū)分離的3株CC14型菌株(1/2a血清型)也攜帶有LGI2，提示LGI2可以在不同CC型、血清型菌株間轉(zhuǎn)移。具有抵抗季胺類消毒劑功能的LGI1存在于加拿大的CC8菌株中[35]，尚未在我國菌株中發(fā)現(xiàn)，可能與我國不同的消毒劑暴露劑量有關(guān)。本研究中菌株XYSN是Yin Y等在羊的李斯特菌病暴發(fā)事件中分離的1株高毒力的4h血清型菌株，同時(shí)攜帶單增李斯特菌的LIPI-1和伊氏李斯特菌的LIPI-2部分片段[27]，提示除了常見的家系Ⅰ和家系Ⅱ致病菌株之外，可能還存在尚未發(fā)現(xiàn)的新的單增李斯特菌毒力變異株，應(yīng)重視對這類菌株的識別和監(jiān)測[1]。

本研究表明，我國分離的單增李斯特菌在基因組水平呈現(xiàn)出不同的種群特征，基因組結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，不同來源的菌株在進(jìn)化關(guān)系上差異不明顯。全部菌株中均攜帶毒力島LIPI-1，部分家系Ⅰ菌株攜帶毒力島LIPI-3和LIPI-4，具有潛在的高致病性。家系Ⅱ菌株的質(zhì)粒和環(huán)境抗性基因的攜帶率都較高，可能與菌株的環(huán)境適應(yīng)力增強(qiáng)有關(guān)。食品菌株中InlA蛋白的提前終止發(fā)生率高于臨床菌株，可能會降低菌株的侵襲力。同時(shí)，基因組島LGI2在不同菌株中的分布以及4h血清型高毒力菌株出現(xiàn)，應(yīng)在我國單增李斯特菌的監(jiān)測中加以重視。

利益沖突：無