黃珊珊,宋秀宇,徐巧麗,饒慧華,張加勤

變異鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是口腔主要致齲菌之一，至今無特效藥根治齲齒。變異鏈球菌感染口腔后粘附牙齒表面形成生物膜，并在其保護(hù)下分解糖類，產(chǎn)生酸代謝產(chǎn)物，引發(fā)齲齒[1]。而在致齲的過程中，變異鏈球菌需克服各種生存環(huán)境的改變生長，這主要依賴原核生物信號傳導(dǎo)雙組份系統(tǒng)(two-component system,TCS)的調(diào)控作用[2]。TCS可參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種生物學(xué)作用，如細(xì)胞壁形成、粘附、毒力、氧化應(yīng)激反應(yīng)等[3]。S.mutansUA159可編碼14 種TCSs，VicRK雙組分系統(tǒng)為其中之一，與細(xì)菌毒力相關(guān)，VicK為組氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)，VicR為可與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(Response Regulator，RR)[4]。

HATPase_c結(jié)構(gòu)域(CA區(qū))是VicK中具有ATP酶活性的特征性區(qū)域，顯示激酶活性，是細(xì)菌激酶磷酸化的始動環(huán)節(jié)。以往人們對VicK的研究大多是敲除整個vicK基因，沒有單獨對HATPase_c結(jié)構(gòu)域的ATP激酶活性進(jìn)行研究。為研究vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌的影響，本研究采用同源重組的方法敲除vicK基因ATP結(jié)合位點核心區(qū)域(命名為ΔvicKATP基因)，驗證其蛋白ATP激酶活性，構(gòu)建補(bǔ)償菌株，觀察vicK基因ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌生長、產(chǎn)酸耐酸、胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)和生物膜形成能力等生物學(xué)功能的影響。

1 材料和方法

1.1菌株和質(zhì)粒 變異鏈球菌UA159由第四軍醫(yī)大饋贈；質(zhì)粒pCrePA和pIB107由堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心 Biswas Indranil 教授惠贈；pET-His、E.coliDH5、E.coliBL21(DE3)、pET-21(b)、pDLP為前期實驗構(gòu)建。

1.3實驗步驟

1.3.1vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用expasy、phyre2和軟件TargetATPsite[5]預(yù)測HATPase_c結(jié)構(gòu)域和其中的ATP結(jié)合位點，設(shè)計引物敲除vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合位點的核心區(qū)域。

1.3.2vicKATP突變同源重組載體構(gòu)建 以變異鏈球菌UA159基因組DNA為模板，引物見表1，PCR擴(kuò)增vicK-X1-267片段，將vicK-X1-267片段和pET-His載體分別用BamHI/NheI酶切，T4 DNA連接酶建立連接體系，轉(zhuǎn)化E.coliDH5感受態(tài)細(xì)胞，氨芐西林(Ampicillin,Amp)(100 g/mL)篩選陽性菌落，37 ℃過夜培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒獲得重組載體pET-His-vicK-X1-267(pK1)。利用quickchange primer design設(shè)計引物，用quick change法構(gòu)建vicKATP基因突變質(zhì)粒，同時引入SmalI平末端酶切位點。quick change法建立反應(yīng)體系：templet(pK1)1 μL(50 ng/μL)，5×FastPfu reaction buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，F(xiàn)astPfu 0.5 μL，qF1、qR1各2 μL(10 μmol/L)，加滅菌水至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，55～60 ℃退火45 s，68 ℃延伸15 min，95 ℃變性，17 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃永久。DpnI處理PCR產(chǎn)物，50 μL PCR產(chǎn)物中加入0.5 μLDpnI，37 ℃水浴5 h。由于模板DNA上有甲基化位點，而用PCR新擴(kuò)增出來的DNA無甲基化修飾，DpnI可識別DNA序列上的甲基化位點，切斷野生型模板DNA，留下突變DNA。測序驗證成功的載體pET-His-vicKATP命名為pK2。SmalI酶切pK2，以質(zhì)粒pIB107為模板，PCR擴(kuò)增kan基因盒(lox71-kan-lox66)，用PfIu DNA polymeras將lox71-kan-lox66片段補(bǔ)平，連接，轉(zhuǎn)化。Amp(100 g/mL)和卡那霉素(Kanamycin，Kan)(50 g/mL)篩選陽性菌落，獲得同源重組載體pK2：loxPkan(pK3)，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定成功。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.3.3UA159 SΔvicKATP突變株構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[6]，將pK3經(jīng)BamHI線性化后，CSP催化轉(zhuǎn)化UA159，并接種于含Kan(300 g/mL)的Todd-Hewitt Broth plus 0.2%Yeast Extract(THY)固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，篩選陽性克隆菌落(SΔvicKATP::kan)。同法將熱敏質(zhì)粒pCrePA轉(zhuǎn)化SΔvicKATP::kan突變株，pCrePA含emr基因，接種含紅霉素(Erythromycin，Em)(10 g/mL)的THY固體培養(yǎng)基，30 ℃ 48 h篩選陽性菌落，利用Cre酶識別loxP位點剔除kan基因。轉(zhuǎn)種37 ℃培養(yǎng)基過夜使pCrePA質(zhì)粒丟失。挑取單個菌落平行接種300 g/mL Kan、10 g/mL Em和無抗性THY固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。篩選Kanr和Emr平板不生長，無抗性平板上生長的菌落，即無標(biāo)記SΔvicKATP突變株。測序鑒定。

1.3.4UA159vicKATP補(bǔ)償株構(gòu)建 以UA159基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增vicK基因開放閱讀框。vicK片段和穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDLP分別用NdeI/KpnI酶切，連接，轉(zhuǎn)化，Kan(50 g/mL)LB平板篩選陽性菌落。所獲質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定成功即為補(bǔ)償質(zhì)粒pDLP-vicK(pK4)。補(bǔ)償質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SΔvicKATP突變株，方法和步驟同上所述，含300 μg/mL KanrTHY平板篩選并獲得vicKATP補(bǔ)償株為SvicK。

1.3.5RT-PCR驗證vicK基因轉(zhuǎn)錄 提取UA159、SΔvicKATP突變株和SvicK補(bǔ)償株RNA，合成第一鏈cDNA，PCR擴(kuò)增cDNA的vicK產(chǎn)物。驗證SΔvicKATP突變株和SvicK補(bǔ)償株的vicK基因轉(zhuǎn)錄活性。

1.3.6vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域缺失蛋白表達(dá)純化和ATP酶活性檢測 分別以UA159和SΔvicKATP突變株基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增vicK基因開放閱讀框。BamHI和HindIII雙酶切表達(dá)載體pET-21(b)、vicK基因和vicKATP基因片段，連接，轉(zhuǎn)化，Ampr LB平板篩選陽性菌落。所獲質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定成功即為表達(dá)載體pET-21(b)-vicK和pET-21(b)-ΔvicKATP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)獲得pET-21(b)-vicK-BL21和pET-21(b)-ΔvicKATP-BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，Ni-NTA SefinoseTM純化蛋白。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析初步鑒定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7細(xì)菌培養(yǎng) 生物學(xué)功能實驗均將UA159、SΔvicKATP突變株和SvicK補(bǔ)償株在37 ℃、5% CO2條件下靜置過夜培養(yǎng)。

1.3.8生長速率 將菌株分別以1∶100比例接種50 mL THY液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)。每隔1 h讀取OD600值，對數(shù)生長期(OD600≈0.5)每隔30 min讀取1次數(shù)值。重復(fù)3次實驗取平均值，記錄數(shù)值并作曲線圖。

1.3.9產(chǎn)酸實驗 將菌株分別以1∶20比例接種THY培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)。每隔1 h測量pH值，分別為0、1、2、3、4、5、6 h。重復(fù)3次實驗取平均值，記錄數(shù)值并繪制曲線圖。

1.3.10酸耐受實驗 分別取菌株1 mL，生理鹽水洗滌。加200 μL 0.05 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.8)，分別反應(yīng)60 min、90 min，各取100 μL 菌液梯度稀釋鋪板。置37 ℃培養(yǎng)48 h。菌落計數(shù)，重復(fù)3 次實驗取平均值，并繪圖。

1.3.11生物膜培養(yǎng) 將菌株轉(zhuǎn)種到THY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600≈0.5)，以1∶100比例接種于50 mL含0.5%蔗糖的THY培養(yǎng)基，取1 mL 稀釋物注入無菌的十二孔平底培養(yǎng)板中，并分別放入一張無菌蓋玻片，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，洗滌培養(yǎng)板去除未粘附細(xì)菌，風(fēng)干，每孔加入250 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液覆蓋孔底，室溫染色5 min，水洗多余染液并風(fēng)干，鏡下觀察生物膜。1 mL(乙醇∶丙酮=8∶2)的萃取液萃取生物膜，酶標(biāo)儀檢測OD570吸光度值。

1.3.12掃描電鏡(SEM)觀察生物膜及EPS形成情況 生物膜培養(yǎng)后，取出硅片，PBS吹打洗滌細(xì)菌，除去表面生物膜的殘留雜質(zhì)，2.5%戊二醛固定10～20 min，30%、50%、70%、90%、100%乙醇各10～20 min干燥杯中脫水，再從乙醇逐步過渡到叔丁醇，干燥杯4 ℃貯存，電鏡室冷凍干燥，噴金后電鏡觀察。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖分析，應(yīng)用雙因素方差分析(two-way ANOVA)比較實驗組和對照組ATP激酶活性、產(chǎn)酸、酸耐受差異，應(yīng)用單因素方差分析非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis test)比較實驗組和對照組生物膜形成差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域預(yù)測vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域和其ATP結(jié)合位點如圖1所示。設(shè)計引物對ATP結(jié)合位點核心區(qū)域396-402 aa進(jìn)行缺失突變，vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域和其ATP結(jié)合位點位置推斷突變位置不影響vicK基因其他功能結(jié)構(gòu)域的表達(dá)。

A：HATPase_c結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B：ATP結(jié)合位點預(yù)測

2.2UA159 SΔvicKATP突變株構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建成功的同源重組載體pK3經(jīng)BamHI線性化后轉(zhuǎn)化UA159，在Kanr平板上生長說明lox71-kan-lox66已經(jīng)成功整合到UA159基因組。熱敏質(zhì)粒pCrePA轉(zhuǎn)化ΔvicKATP::kan突變株，利用Cre酶識別loxP位點可剔除kan基因。37 ℃使pCrePA質(zhì)粒丟失。突變株在Kanr和EmrTHY平板上不生長，只在無抗性THY平板上生長，驗證kan基因和pCrePA質(zhì)粒均成功去除，成功構(gòu)建無標(biāo)記SΔvicKATP突變株。SΔvicKATP突變株測序結(jié)果顯示vicK基因的ATP結(jié)合位點序列已缺失，只存留38 bp的loxP位點(圖2)。

紅色方框內(nèi)為刪除kan基因后殘留38 bp的loxP位點

2.3UA159vicK補(bǔ)償株構(gòu)建與鑒定 將構(gòu)建成功的補(bǔ)償質(zhì)粒pDLP-vicK(pK4)轉(zhuǎn)化vicKATP突變株，Kanr的THY平板篩選獲得vicK補(bǔ)償株。由于SΔvicKATP突變株刪除了ATP結(jié)合位點核心區(qū)域21 bp，引入lox71-kan-lox66，而Cre重組酶識別loxP位點刪除kan基因后殘留兩端38 bp的loxP位點，用PCR擴(kuò)增vicK基因和突變基因產(chǎn)物大小區(qū)別不大，無法區(qū)分驗證突變株和補(bǔ)償株，且無法確定補(bǔ)償vicK基因是否有轉(zhuǎn)錄活性。因此，對陽性轉(zhuǎn)化SvicK補(bǔ)償株和SΔvicKATP突變株vicK基因轉(zhuǎn)錄情況用RT-PCR驗證。結(jié)果如下圖所示，SΔvicKATP突變株RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果無相關(guān)條帶出現(xiàn)，進(jìn)一步說明SΔvicKATP突變株構(gòu)建成功，SvicK補(bǔ)償株vicK基因有轉(zhuǎn)錄活性(圖3)。

1：突變株SΔvicKATP RNA的RT-PCR擴(kuò)增vicK產(chǎn)物；2：突變株SΔvicKATP cDNA 的RT-PCR擴(kuò)增vicK產(chǎn)物；3：突變株SΔvicKATP cDNA 的RT-PCR擴(kuò)增gyrA內(nèi)參產(chǎn)物；4：補(bǔ)償株SvicK RNA的RT-PCR擴(kuò)增vicK產(chǎn)物；5：補(bǔ)償株SvicK cDNA的RT-PCR擴(kuò)增vicK產(chǎn)物；6：補(bǔ)償株SvicK cDNA的RT-PCR擴(kuò)增gyrA內(nèi)參產(chǎn)物；7：UA159野生株基因組的PCR擴(kuò)增vicK產(chǎn)物；8：UA159野生株基因組的PCR擴(kuò)增gyrA內(nèi)參產(chǎn)物；9：陰性對照；M：DNA Marker DL2000

2.4vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域缺失蛋白表達(dá)純化和ATP酶活性檢測 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，ΔVicKATP蛋白為45.7 kDa，VicK蛋白為50 kDa。Ni-NTA SefinoseTM純化蛋白，imidazole濃度400 mmol/L洗脫目的蛋白(圖4)。檢測ΔVicKATP蛋白和VicK蛋白的ATP激酶活性，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5A)。結(jié)果提示隨ATP濃度增加，發(fā)光強(qiáng)度增加。蛋白ATP酶活性越高，結(jié)合ATP能力越強(qiáng)，導(dǎo)致游離ATP減少，發(fā)光強(qiáng)度降低，即蛋白ATP酶活性與發(fā)光強(qiáng)度成反比。隨著兩種蛋白摩爾濃度增加，VicK蛋白發(fā)光強(qiáng)度呈明顯降低趨勢，而ΔVicKATP蛋白發(fā)光強(qiáng)度無明顯變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FVicK-ΔVicKATP=22.87,P<0.05)(圖5B)。結(jié)果顯示，VicK蛋白的ATP激酶活性明顯高于ΔVicKATP蛋白，ΔVicKATP蛋白幾乎失去ATP激酶活性。驗證了SΔvicKATP突變株構(gòu)建成功，缺失了ATP的結(jié)合能力。

1:對照株E.coli BL21(DE3)裂解上清液；2: pET-21(b)-ΔvicKATP-BL21裂解上清液及純化蛋白；3: pET-21(b)-vicK-BL21裂解上清液及純化蛋白；4：pET-21(b)-ΔvicKATP-BL21裂解沉淀物；5：pET-21(b)-vicK-BL21裂解沉淀物；M：蛋白質(zhì)marker

A：標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：不同摩爾濃度ΔVicKATP蛋白和VicK蛋白ATP激酶活性；*P<0.05，compared with ΔVicKATP protein

2.5生長曲線 每隔60 min測量OD600。與野生株UA159比較，SΔvicKATP突變株生長較為緩慢，但穩(wěn)定期基本可達(dá)到同一水平，而SvicK補(bǔ)償株基本恢復(fù)至野生株的生長水平，見圖6。

圖6 UA159、SΔvicKATP突變株和SvicK補(bǔ)償株的生長曲線

2.6產(chǎn)酸實驗 相比野生株，隨時間增加SΔvicKATP突變株P(guān)H值下降更緩慢，即突變株產(chǎn)酸量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q1、2、3、4、5、6:WT-SΔvicKATP=7、8.875、18.35、40.83、99.03、10,P<0.05)。SvicK補(bǔ)償株pH值下降也較野生株緩慢，產(chǎn)酸量稍減少，部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q2、3、4、5:WT-SvicK=13、61、116、164,P<0.05)，但沒有突變株明顯，說明ATP結(jié)合位點突變使菌株產(chǎn)酸量減少，補(bǔ)償株不能完全恢復(fù)到野生株水平(圖7)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.005,****P<0.001,compared with WT

2.7酸耐受實驗 在致死性酸性環(huán)境中(pH 2.8)，隨著酸處理時間延長，UA159、SΔvicKATP突變株、SvicK補(bǔ)償株生存率呈下降趨勢，但與野生株相比，SΔvicKATP突變株反而下降的更少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q60:WT-90:WT=45.20,q60:WT-90:SΔvicKATP=14.14,q60:WT-90: SvicK=34.96,P<0.05)，提示突變株耐酸性增高。90 min時，補(bǔ)償株和野生株差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q90:WT-SvicK=23.03,P<0.05)，提示隨酸處理時間增加，ATP結(jié)合位點突變對酸耐受性增加(圖8)。

*P<0.05,**P<0.01,compared with WT60；#P<0.05, compared with WT90

2.8vicK基因ATP結(jié)合位點突變對變異鏈球菌生物膜及EPS形成的影響 與野生株相比，SΔvicKATP突變株生物膜形成明顯減少，粘附力降低，且致密性降低，補(bǔ)償株SvicK生物膜形成能力基本與野生株相當(dāng)(圖9)。用配制的溶液萃取生物膜，將萃取液于OD570檢測，結(jié)果與結(jié)晶紫染色一致：突變株與野生株比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.695,P<0.05)，說明SΔvicKATP突變株使變異鏈球菌生物膜形成能力降低。補(bǔ)償株與野生株比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，從圖9中看出補(bǔ)償株起到了部分補(bǔ)償作用，但還是有一定差異。電鏡SEM結(jié)果觀察到：SΔvicKATP突變株玻片上的生物膜比野生株薄，與生物膜培養(yǎng)結(jié)晶紫染色結(jié)果一致，細(xì)菌量比野生株少，EPS生成量相比野生株明顯減少，補(bǔ)償株幾乎恢復(fù)到野生株水平(圖10)。

A：生物膜形成；B：光學(xué)顯微鏡下生物膜形態(tài)(100倍)；C：生物膜萃取液OD570值；*P<0.05,compared with WT

A：50 000倍；B：5 000倍

3 討 論

TCS由位于膜上的組氨酸激酶受體HK和位于胞內(nèi)的調(diào)節(jié)子RR組成[7]。HK感受外界信號并發(fā)生自磷酸化，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RR上將其磷酸化，調(diào)控下游目的基因表達(dá)[3,8]。HK由N端傳感器復(fù)合體和C端催化中心組成。N端包括胞外感受區(qū)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)感受區(qū)(HAMP、PAS)[9]。C端包括DHp和HATPase_c結(jié)構(gòu)域(CA區(qū))。HATPase_c結(jié)構(gòu)域具有催化活性并含有 ATP 結(jié)合位點，識別結(jié)合ATP，并呈遞磷酸基團(tuán)給DHp區(qū)的His217，使其發(fā)生自身磷酸化，是細(xì)菌激酶磷酸化的始動環(huán)節(jié)[10]。細(xì)菌HATPase_c結(jié)構(gòu)域在人體中沒有發(fā)現(xiàn)，近年來已成為抗菌藥物研究的重要靶點[11]。研究表明雙組分系統(tǒng)主要存在于細(xì)菌、一些低等真核生物和一些原生動物中，在人體真核細(xì)胞中卻不存在[12]，因此可通過研究雙組分系統(tǒng)蛋白毒力調(diào)節(jié)機(jī)制，尋找變異鏈球菌雙組分系統(tǒng)中的藥物新靶點，特異高效地抑制病原菌而對宿主不造成影響。

變異鏈球菌中的雙組分VicRK系統(tǒng)的vicK基因，其編碼的組氨酸激酶VicK感受外界刺激信號并傳遞給應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白VicR，開始信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯[13]。因此，vicK基因在變異鏈球菌調(diào)節(jié)毒力機(jī)制作用的研究至關(guān)重要。研究表明，vicK基因?qū)ψ儺愭溓蚓纳L、產(chǎn)酸、耐酸、粘附力、氧化應(yīng)激、生物膜和糖酵解均有調(diào)控作用，對產(chǎn)生EPS研究較少，EPS對細(xì)菌生物膜形成和毒力均有重要作用[2,4,14-16]。這些大多是敲除整個vicK基因的研究結(jié)果。但VicRK是復(fù)雜的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，VicK不僅有組氨酸激酶活性，還有磷酸酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。為研究vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點激酶磷酸化功能對變異鏈球菌的影響，本研究通過敲除vicK基因ATP結(jié)合位點，觀察vicK基因ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌生物學(xué)功能的影響。研究表明，VicK蛋白的保守氨基酸殘基P222、T221和A439有磷酸酶活性，其中P222、T221點突變，VicK蛋白失去磷酸酶活性，A439位點缺失突變，VicK蛋白磷酸酶活性顯著降低；A439和W443有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，突變后VicK蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶活性顯著降低10。本研究中對HATPase_c結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點核心區(qū)域396-402 aa進(jìn)行缺失突變，突變位點不涉及已知磷酸酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性位點，保留了磷酸酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，VicK蛋白氨基酸全長450 aa，HATPase_c結(jié)構(gòu)域位于C端323-435 aa，突變位置不影響vicK基因其他功能結(jié)構(gòu)域的表達(dá)。

為研究vicK基因ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌生物學(xué)功能的影響，本研究用基因克隆和quick change法成功構(gòu)建了vicKATP基因突變同源重組表達(dá)載體。利用Cre-loxP系統(tǒng)和同源重組法將ATP結(jié)合位點突變的目的基因整合到變異鏈球菌的基因組中，穩(wěn)定表達(dá)突變目的基因，成功構(gòu)建SΔvicKATP突變株。利用Cre酶識別并刪除引入的lox71-kan-lox66抗性基因盒，構(gòu)建無標(biāo)記的SΔvicKATP突變株。同時，克隆vicK片段，采用穿梭表達(dá)質(zhì)粒pDLP轉(zhuǎn)化SΔvicKATP突變株，成功構(gòu)建具有vicK基因轉(zhuǎn)錄活性的補(bǔ)償株SvicK。成功構(gòu)建VicKATP蛋白表達(dá)株，表達(dá)純化蛋白，并檢測其幾乎失去ATP酶活性，驗證了SΔvicKATP突變株構(gòu)建成功，缺失了ATP的結(jié)合能力。通過描繪生長曲線、產(chǎn)酸、酸耐受、EPS和生物膜等生物學(xué)功能實驗，研究vicK基因ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌的影響。研究結(jié)果顯示：與野生株UA159比較，SΔvicKATP突變株生長和產(chǎn)酸都受到抑制，酸耐受性增強(qiáng)，SvicK補(bǔ)償株不能完全恢復(fù)到野生株水平；生物膜通過結(jié)晶紫染色、電鏡SEM觀察，SΔvicKATP突變株生物膜形成明顯減少，粘附力降低，且致密性降低，生物膜形成能力降低，補(bǔ)償株SvicK生物膜形成能力基本與野生株相當(dāng)，其中SEM還觀察到SΔvicKATP突變株EPS生成量相比野生株明顯減少。實驗結(jié)果與S.mutansUA159的vicK基因全敲除結(jié)果大致相同，揭示vicK基因HATPase_c結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點對變異鏈球菌生物學(xué)功能和毒力機(jī)制有重要影響，具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

變異鏈球菌vicKATP基因的成功敲除及生物學(xué)功能研究，為進(jìn)一步研究變異鏈球菌vicK基因ATP結(jié)合位點表達(dá)調(diào)控毒力機(jī)制提供了無標(biāo)記基因缺陷株模型和實驗依據(jù)，為研發(fā)抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無