曹得萍，張耀剛，姜博璠，李建華，龐明泉,4，陳 根

棘球蚴病是一種對(duì)人類危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，俗稱包蟲(chóng)病。包蟲(chóng)病最常見(jiàn)的兩種類型分別是細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染所致的細(xì)粒棘球蚴病和多房棘球蚴病。我國(guó)受包蟲(chóng)病威脅的高危人口有5 000萬(wàn)，被感染的家畜及其它動(dòng)物超過(guò)億頭(只)[1]。包蟲(chóng)病病程長(zhǎng)，治療費(fèi)用較高，給患者及其家庭帶來(lái)極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前包蟲(chóng)病仍然是我國(guó)西部農(nóng)牧區(qū)感染最為嚴(yán)重的人獸共患病之一[2]。多房棘球蚴病對(duì)人類的危害更大，感染后幾乎100%原發(fā)在肝臟，其它部位的病變是由肝臟轉(zhuǎn)移而來(lái)的，其生長(zhǎng)方式類似惡性腫瘤，又稱為“蟲(chóng)癌”[3]。目前對(duì)細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染后的免疫機(jī)制還不甚明了，本研究通過(guò)腹腔注射細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)建立繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴病和多房棘球蚴病Balb/c小鼠模型，利用流式細(xì)胞術(shù)探討感染細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴小鼠脾臟和血液中T、B、Th1、Th2、Treg、NK細(xì)胞變化情況，旨在探討T、B、Th1、Th2、Treg、NK細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型中的免疫作用，為進(jìn)一步研究細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染的免疫機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1建立細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠模型

1.1.1細(xì)粒棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 收集西寧市屠宰場(chǎng)綿羊肝臟細(xì)粒棘球蚴囊泡，在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌狀態(tài)下收集囊內(nèi)原頭節(jié)，無(wú)菌含雙抗(青霉素1 000 U/mL，鏈霉素1 000 U/mL)洗滌3次，配成6 000個(gè)/mL懸液備用。選取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只小鼠右下腹0.5 mL原頭節(jié)懸液注射。

1.1.2多房棘球蚴感染Balb/c小鼠模型建立 剖殺多房棘球蚴保種沙鼠，無(wú)菌取出多房棘球蚴囊泡，眼科剪剪碎，分離原頭節(jié)，無(wú)菌含雙抗(青霉素1 000 U/mL，鏈霉素1 000 U/mL)洗滌3次，配成6 000個(gè)/mL懸液備用。選取18～20 g左右Balb/c雌性小鼠30只，每只右上腹做一小手術(shù)切口，暴露右葉肝臟，注射0.2 mL原頭節(jié)懸液后縫合切口。6個(gè)月后剖殺小鼠，提取脾臟淋巴細(xì)胞。取20只小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水作為對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離 稱取0.1 g小鼠脾臟置于無(wú)菌小培養(yǎng)皿中，利用5 mL注射器芯在70目的篩網(wǎng)上研磨，去除纖維組織等，邊研磨邊加入勻漿沖洗液，使細(xì)胞全部通過(guò)篩網(wǎng)到小培養(yǎng)皿中。棄去篩網(wǎng)，組織研磨液經(jīng) 1 000 rpm/min離心 10 min，棄上清。用樣本稀釋液重懸組織細(xì)胞，將細(xì)胞懸液調(diào)整為2×108～1×109/mL的細(xì)胞濃度為宜，約使用 1 mL 樣本稀釋液重懸細(xì)胞，備用。淋巴細(xì)胞分離按照天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司的淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)流程進(jìn)行。

1.2.2小鼠血液淋巴細(xì)胞提取 小鼠進(jìn)行眼球摘除采血，血液滴入一次性的抗凝真空抽血管，在無(wú)菌的塑料離心管中加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液，在裝有小鼠血樣的真空管中加入等量PBS混勻。緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使血樣盡量位于提取液上層，然后1 500 rpm/min離心15 min。

1.2.3細(xì)胞抗體標(biāo)記上機(jī)檢測(cè) CD3+、CD4+、CD8+、CD19、CD25、CD16/CD32單抗孵育約30 min，上機(jī)檢測(cè)(機(jī)型：BD FACSCelesta)。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 細(xì)胞比例以百分?jǐn)?shù)表示，GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖制作，用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組獨(dú)立樣本比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群 T細(xì)胞在多房棘球蚴感染組(56.95±13.09)%和對(duì)照組(57.79±5.71)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.025，P>0.05)；NK細(xì)胞在多房棘球蚴感染組(12.3±5.65)%和對(duì)照組(11.02±4.03)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.800，P>0.05)。B、Th1、Th2、Treg細(xì)胞在多房棘球蚴感染組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tB=4.239,P<0.05;tTh1=2.965,P<0.05;tTh2=2.403,P<0.05;tTreg=2.752，P<0.05)；T細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組(64.71±21.26)%和對(duì)照組(57.97±5.71)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.271，P>0.05)；NK細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組(10.97±3.56)%和對(duì)照組(11.02±4.03)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.029，P>0.05)，B、Th1、Th2、Treg細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tB=3.396,P<0.05;tTh1=3.539,P<0.05;tTh2=3.731,P<0.05;tTreg=2.197，P<0.05)。結(jié)果如表1和圖1、圖2。

表1 細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群比例變化

對(duì)照：無(wú)感染多房棘球蚴小鼠組；實(shí)驗(yàn)：感染多房棘球蚴小鼠組

對(duì)照：無(wú)感染細(xì)粒棘球蚴小鼠組；實(shí)驗(yàn)：感染細(xì)粒棘球蚴小鼠組

2.2流式細(xì)胞儀分析小鼠血液淋巴細(xì)胞亞群 T、B、Treg、NK細(xì)胞在多房棘球蚴感染組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tT=0.029,P>0.05;tB=1.746,P>0.05;tTreg=2.183,P>0.05;tNK=1.690，P>0.05)，Th1、Th2在多房棘球蚴感染組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tTh1=3.669,P<0.01;tTh2=4.302，P<0.01)；T細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組(70.31±9.84)%和對(duì)照組(61.92±9.02)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.967，P>0.05)，Treg細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組(6.29±3.39)%和對(duì)照組(7.39±2.18)%比較，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.923，P>0.05)；B、NK、Th1、Th2細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tB=2.125,P<0.05;tNK=3.569,P<0.05;tTh1=6.532,P<0.05;tTh2=4.463，P<0.05)。結(jié)果如表2和圖3、圖4。

表2 細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴感染Balb/c小鼠血液淋巴細(xì)胞亞群比例變化

對(duì)照：無(wú)感染多房棘球蚴小鼠組；實(shí)驗(yàn)：感染多房棘球蚴小鼠組

對(duì)照：無(wú)感染細(xì)粒棘球蚴小鼠組；實(shí)驗(yàn)：感染細(xì)粒棘球蚴小鼠組

3 討 論

T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用，承擔(dān)著腫瘤免疫監(jiān)視作用[4]。T淋巴細(xì)胞主要分為CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群，在宿主防御反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的疾病中起著決定性作用[5]。在寄生蟲(chóng)感染的免疫應(yīng)答中，CD4+T細(xì)胞各亞群，尤其是輔助性T(Th)細(xì)胞具有關(guān)鍵作用。寄生蟲(chóng)進(jìn)入機(jī)體后，宿主體內(nèi)具有抗原特異的T、B細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)形成抑制或促進(jìn)寄生蟲(chóng)的死亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)Th1與Th2兩種細(xì)胞在寄生蟲(chóng)感染的宿主免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，棘球蚴通過(guò)增加Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)和抑制Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)干預(yù)宿主的細(xì)胞免疫[7-8]。

本研究中，多房棘球蚴感染小鼠脾臟中Th1/Th2比值約為2.8∶1，說(shuō)明多房棘球蚴感染后血液中主要以Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。多房棘球蚴組Treg細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比較有所減少，說(shuō)明機(jī)體的體液免疫有所抑制而細(xì)胞免疫起主導(dǎo)作用。究其原因可能是多房棘球蚴的生物學(xué)特性類似腫瘤，在多房棘球蚴寄生的微環(huán)境中寄生蟲(chóng)釋放抗原刺激機(jī)體激發(fā)了細(xì)胞免疫。細(xì)粒棘球蚴感染小鼠脾臟中Th1/Th2比值約為1.6∶1，說(shuō)明細(xì)粒棘球蚴感染后主要以Th2介導(dǎo)的體液免疫為主，小鼠體內(nèi)以Th2型T細(xì)胞的反應(yīng)起主導(dǎo)作用。細(xì)粒棘球蚴的囊壁將囊內(nèi)容物與周圍肝臟組織隔絕，從而使宿主體液免疫幾乎不能影響到蟲(chóng)體的存活和增殖。Rigano等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)主要抗原分子B可使PBMC產(chǎn)生Th1/Th2比值改變，傾向于病理免疫相關(guān)的Th2型反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)細(xì)粒棘球蚴感染組脾臟中的Th1/Th2比值結(jié)果與此文獻(xiàn)結(jié)果一致。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)通常是指CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞，是一種具有免疫抑制功能的細(xì)胞亞群，通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)的方式抑制存在于機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答[10]，具有干擾免疫療法的作用[11]。機(jī)體感染寄生蟲(chóng)后發(fā)生了抗寄生蟲(chóng)感染免疫，機(jī)體產(chǎn)生免疫病理?yè)p傷，當(dāng)寄生蟲(chóng)感染進(jìn)展到慢性期時(shí)，Treg細(xì)胞水平上升抑制炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)機(jī)體的作用[12]。Treg細(xì)胞在多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴感染組小鼠脾臟中的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在血液中Treg細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這可能是由于寄生蟲(chóng)抗原在脾臟刺激各種淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，Treg細(xì)胞則可能要起調(diào)節(jié)作用，故引起Treg細(xì)胞比例變化。但是血液中多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴感染組Treg細(xì)胞變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這或許是本研究中樣本數(shù)量問(wèn)題，又或許這本身就是多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴感染后外周血淋巴細(xì)胞的一個(gè)特征。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)肝臟髓源抑制性細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例增加，提示在小鼠感染細(xì)粒棘球蚴中后期Treg細(xì)胞發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

本研究的目的是分析感染這兩種棘球蚴后小鼠脾臟和血液免疫細(xì)胞的變化情況，為弄清感染棘球蚴后機(jī)體的免疫機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)研究中將動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠脾臟和血液各淋巴細(xì)胞亞群變化情況，尤其從CD4+、CD8+、Treg細(xì)胞分型等分析多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴感染過(guò)程中機(jī)體的免疫機(jī)制。

利益沖突：無(wú)