余南燕，向文靜，周 洲

衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，以二分裂的方式進(jìn)行繁殖，具有獨(dú)特的雙相發(fā)育周期。其中，引起人類疾病的主要有沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae, Cpn)和鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci, Cps)。Ct感染眼部可引起結(jié)膜炎、沙眼等疾?。桓腥灸行悦谀虻?，引起尿道炎、前列腺炎和附睪炎；感染女性生殖道，容易發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、尿道炎并導(dǎo)致盆腔炎、輸卵管性不孕、異位妊娠等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，Ct感染既可增加人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染機(jī)會(huì)，也可與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)協(xié)同作用誘發(fā)宮頸癌變[1-2]。Cpn不僅造成呼吸系統(tǒng)感染，而且與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病以及哮喘、多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等多種慢性病相關(guān)。Cps是一種人獸共患病原體，傳染性極高，通常呈全身性感染，主要表現(xiàn)為非典型性肺炎。研究表明，Cps是引起全球1%社區(qū)獲得性肺炎的病原體[3]?？傊?，衣原體感染導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，給各國(guó)公共醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，長(zhǎng)期或重復(fù)使用抗生素易產(chǎn)生耐藥性[4]，增加衣原體反復(fù)感染后形成輸卵管性不孕等嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。免疫接種不僅能預(yù)防個(gè)體感染，避免感染后引發(fā)嚴(yán)重的病理反應(yīng)，而且能有效降低衣原體的傳播速度。因此，迫切需要開發(fā)一種針對(duì)不同宿主、不同菌株的有效疫苗來預(yù)防衣原體感染，控制衣原體的傳播、流行。

1 衣原體疫苗的研究策略

1956年，中國(guó)科學(xué)家湯飛凡等利用雞胚接種的方法培養(yǎng)了眼型Ct[5]，隨后Collier LH等將沙眼衣原體進(jìn)行體外培養(yǎng)，模擬衣原體的自然感染，探索其免疫機(jī)制和致病機(jī)制[6-7]，開啟衣原體疫苗研究的新征程。目前人類在衣原體免疫機(jī)制的研究和疫苗開發(fā)方面已經(jīng)取得了一定的突破，研究表明，衣原體疫苗免疫接種的免疫效果受多種因素影響，如抗原能否誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)性；不同類型菌株之間的遺傳差異；宿主的種類及狀態(tài)；疫苗的運(yùn)輸和保存方式；免疫接種的最佳時(shí)機(jī)和免疫策略等[8]。但是目前仍然沒有成功研制出對(duì)人類有效的衣原體疫苗。

因此，合理選擇潛在的疫苗靶點(diǎn)，開發(fā)有效的衣原體疫苗，需要注意以下幾點(diǎn)：第一，選擇合適的疫苗類型，以確保疫苗在提供最佳保護(hù)的同時(shí)不含潛在的致病成分，比如流產(chǎn)衣原體1B菌株活疫苗可能存在導(dǎo)致羊胚胎流產(chǎn)的成分[9]。第二，疫苗應(yīng)該具有有效的抗原表位和較強(qiáng)的免疫原性，以確保誘導(dǎo)一個(gè)良好的細(xì)胞因子和共刺激環(huán)境，促使疫苗誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)足夠的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和輔助性抗體反應(yīng)。第三，有效的佐劑和適當(dāng)?shù)倪f送系統(tǒng)促使抗原靶向結(jié)合相應(yīng)的免疫位點(diǎn)，增強(qiáng)效應(yīng)器的功能，誘導(dǎo)充分而持久的免疫保護(hù)，預(yù)防或解決感染導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥[10]。目前使用的衣原體疫苗遞送系統(tǒng)分很多種：①M(fèi)F59佐劑，MF59已經(jīng)在抗流感疫苗方面顯示出良好的耐受性，可用于不同菌株或同一菌株不同血清型的衣原體疫苗的開發(fā)[11-12]；②CpG佐劑，可提高疫苗的免疫原性，促進(jìn)快速T細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗體免疫應(yīng)答，但存在安全問題[13]；③病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)媒介佐劑系統(tǒng)，VLP通過樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)上的模式識(shí)別受體進(jìn)行有效的先天免疫刺激，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[14-15]；④病毒載體，通常為復(fù)制缺陷型病毒，如腺病毒載體、痘苗病毒載體、流感病毒載體等，不僅引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)抗原高水平表達(dá)。第四，誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答是衣原體疫苗免疫策略的重點(diǎn)。現(xiàn)有研究表明，鼻腔或舌下接種Ct粘膜疫苗，在生殖道誘導(dǎo)強(qiáng)大的黏膜免疫應(yīng)答[16]。第五，選擇合適的感染模型檢測(cè)疫苗的免疫效果。雖然小鼠、豬的感染模型能夠模擬衣原體的自然感染，且成本低、易繁殖飼養(yǎng)，但其與人類基因存在重要差異，適合基礎(chǔ)研究[17-18]。人類非靈長(zhǎng)類(Non-human primates, NHP)的免疫系統(tǒng)與人類高度相似，但其研究費(fèi)用昂貴，目前僅用于6個(gè)Ct疫苗的研究[18-19]。

2 衣原體疫苗的研究現(xiàn)狀

2.1全菌疫苗 全菌疫苗分為減毒活疫苗和滅活疫苗?；钜呙缫?yàn)槟苣M自然感染、具有固有的佐劑特性，可通過口服或鼻腔注射，以及可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、體液免疫和粘膜免疫反應(yīng)，而具有吸引力[20]。1978年，出現(xiàn)第一批Ct活疫苗[21]，隨后，Kari L等將Ct減毒質(zhì)粒缺失株多次感染獼猴眼部，誘導(dǎo)了相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顯著降低感染率和再感染率，而且沒有產(chǎn)生炎癥性眼部病理反應(yīng)[22]，類似的研究表明，與野生型鼠衣原體(Chlamydiamuridarum，Cm)相比，小鼠接種Cm質(zhì)粒缺失株，輸卵管積水發(fā)生率顯著降低[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道，鼠衣原體減毒突變株(GIAM-1)感染小鼠胃腸道后可產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫，預(yù)防生殖道感染[24]。滅活疫苗的出現(xiàn)解決了減毒活疫苗有效期短、不易保存、難以運(yùn)輸?shù)葐栴}，但不能誘導(dǎo)其產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答。雖然免疫接種之前，通過減毒或滅活的方式削弱活菌的致病性，但是減毒株有可能出現(xiàn)毒力返祖，而且使用重組菌株接種可能會(huì)導(dǎo)致菌株釋放到大自然中，引起生物安全隱患[20]。因此，疫苗的有效性和安全性等問題限制了衣原體全菌疫苗的發(fā)展。

2.2亞單位疫苗及重組亞單位疫苗 亞單位疫苗不含衣原體核酸，僅含衣原體部分蛋白或其表面抗原，接種后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答。相對(duì)于全菌疫苗，亞單位疫苗安全性高，穩(wěn)定性好。具有較強(qiáng)免疫原性的衣原體抗原，如主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)、衣原體蛋白酶樣因子(chlamydial protease-like activity factor, CPAF)和熱休克蛋白60(heat shock protein 60, HSP60)已經(jīng)廣泛用于衣原體亞單位疫苗的研究[25]。

MOMP是衣原體包膜含量最豐富的成分，具有廣泛的種屬特異性，包含多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，是目前衣原體疫苗研究較多的候選抗原。MOMP不僅促進(jìn)衣原體黏附宿主細(xì)胞，而且作為孔蛋白，促進(jìn)小分子物質(zhì)通過外膜，調(diào)節(jié)衣原體的發(fā)育周期，推測(cè)其可能與衣原體原體(elementary body, EB)和網(wǎng)狀體(reticulate body, RB)兩種形式的轉(zhuǎn)換有關(guān)。MOMP免疫小鼠后，可有效預(yù)防生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)衣原體感染，預(yù)防輸卵管性不孕等長(zhǎng)期后遺癥[26-27]。重組主要外膜蛋白(recombinant major outer membrane protein, rMOMP)免疫考拉或小鼠亦可誘導(dǎo)高水平的特異性中和抗體，增強(qiáng)粘膜和全身體液免疫反應(yīng)[28-29]。Tifrea DF等用rMOMP首次實(shí)現(xiàn)預(yù)防不同血清型Ct感染，及其引起的陰道脫落、上生殖器病變和不孕。他們推測(cè)來自不同血清型的rMOMP配制的多價(jià)疫苗會(huì)引起廣泛的交叉免疫保護(hù)[30]。此外，MOMP或rMOMP與磷酸鹽佐劑、納米佐劑以及陽離子脂質(zhì)體佐劑(cationic adjuvant formulation，CAF)01和CAF09等聯(lián)合免疫，可提高抗原特異性免疫，增強(qiáng)小鼠呼吸系統(tǒng)的保護(hù)作用[4,31-32]。

CPAF是一種衣原體絲氨酸蛋白酶，能抑制宿主細(xì)胞的信號(hào)通路，抑制感染細(xì)胞凋亡，依賴抗原特異性CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，對(duì)清除衣原體感染很重要[33]。重組衣原體蛋白酶樣因子(recombinant chlamydial protease-like activity factor, rCPAF)與IL-12或CpG佐劑聯(lián)合免疫小鼠或豚鼠后，可觀察到衣原體脫落顯著減少，且有效預(yù)防Cm感染導(dǎo)致的輸卵管積水、輸卵管擴(kuò)張和動(dòng)脈粥樣硬化等免疫病理改變[34-35]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道稱，CPAF介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞失活是無癥狀Ct感染的關(guān)鍵，因?yàn)镃PAF是逃避宿主天然免疫防御第一道防線的中心效應(yīng)因子。因此，深入了解CPAF介導(dǎo)的免疫機(jī)制，可能為衣原體疫苗的開發(fā)提供新思路。

HSP60既能維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，也可觸發(fā)和增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，增大女性輸卵管性不孕等風(fēng)險(xiǎn)[36]。實(shí)驗(yàn)證明，小鼠免疫接種衣原體HSP60也可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[37]。目前的衣原體疫苗研究中，還有許多其他的可用于設(shè)計(jì)衣原體疫苗的抗原，如巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白(MIP蛋白)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、多形態(tài)膜蛋白(polymorphic membrane protein, Pmp)等。

傳統(tǒng)亞單位疫苗有效的避免了全菌疫苗的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，但面臨抗原提取成本高、純化難、復(fù)性難的挑戰(zhàn)，重組亞單位疫苗的出現(xiàn)解決了抗原大規(guī)模生產(chǎn)的問題。將免疫原性較強(qiáng)的抗原或重組抗原接種到宿主時(shí)，極大地削弱了抗原的免疫原性，以致于不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫反應(yīng)，需通過適當(dāng)?shù)淖魟┗蛎庖咴鰪?qiáng)劑，提高免疫應(yīng)答。而且，單組份、單表位亞單位疫苗不一定能提供最佳的免疫保護(hù)，小鼠衣原體感染模型研究顯示多抗原、多表位疫苗可顯著增強(qiáng)對(duì)跨血清型生殖道衣原體感染的交叉免疫保護(hù)作用[38-40]。因此，未來的衣原體亞單位疫苗研究應(yīng)該進(jìn)一步探索最佳抗原，深入研究衣原體蛋白表位的差異性，拓展多抗原或多表位聯(lián)合免疫的策略。

2.3核酸疫苗 核酸疫苗以DNA疫苗為主，通過在質(zhì)粒中構(gòu)建外源目的基因片段，將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白，以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。DNA疫苗避免了活疫苗毒力返祖的隱患，可輔助T細(xì)胞極化，特別是Th1型免疫細(xì)胞，延長(zhǎng)疫苗的穩(wěn)定性、儲(chǔ)存和運(yùn)輸能力，降低生產(chǎn)成本[41]。研究表明，編碼MOMP的DNA質(zhì)粒疫苗可有效預(yù)防衣原體感染火雞、母鼠、豬等[42-44]，同樣，噬菌體介導(dǎo)的MOMP DNA疫苗可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，預(yù)防流產(chǎn)衣原體感染[41]。小鼠接種由pcDNA質(zhì)粒攜帶MOMP多表位和人乳頭瘤病毒16型L2基因組成的DNA疫苗可以調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生，通過細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷功能來抵抗衣原體感染，減少生殖道病理損傷[45]?？傊珼NA疫苗不僅同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，而且一種載體可以表達(dá)多種目的蛋白，這些優(yōu)勢(shì)促使其成為目前疫苗研究的熱點(diǎn)，但是還有幾個(gè)問題尚待解決：①DNA可能整合到宿主染色體中；②DNA疫苗接種可能產(chǎn)生DNA抗體，發(fā)生自身免疫??；③人類接種DNA疫苗表達(dá)效率較低；④肌肉免疫接種DNA疫苗可能影響二次免疫效果[46]。

2.4DC疫苗 細(xì)胞疫苗作為一種過繼免疫療法，應(yīng)用于治療性和預(yù)防性疫苗的研發(fā)，比如化療和基于抗原的疫苗[47-48]。有效的衣原體疫苗應(yīng)該能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的粘膜免疫反應(yīng)、系統(tǒng)性Th1型免疫反應(yīng)以及再次感染后增強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng)。雖然過繼療法可能不適合衣原體等易廣泛傳播的病原體的研究，但DC是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC)，可產(chǎn)生IL-12，優(yōu)先激活Th1型細(xì)胞反應(yīng)，具有強(qiáng)大的共刺激能力，誘導(dǎo)激活多種免疫應(yīng)答，有助于抗衣原體反應(yīng)[49-50]。早在1998年，Su H等通過在小鼠模型中靜脈注射小鼠骨髓來源的體外脈沖DC，發(fā)現(xiàn)其能有效吞噬衣原體，分泌IL-12 p40，呈遞抗原，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生傾向于Th1型特異性免疫反應(yīng)，而且未引起明顯的病理反應(yīng)[51]。同樣，感染Ct和Cm的小鼠的(骨髓源性)DC呈遞衣原體特異性CD4T細(xì)胞識(shí)別的衣原體蛋白表位，加速鼻腔和生殖道病原體的清除率[50,52]。然而，由于DC迅速降解內(nèi)化的蛋白，以及DC表面的MHC-I類表位在外部負(fù)載基序適配肽后，具有暫時(shí)性，使得DC疫苗的應(yīng)用受到限制[53]。因此，DC疫苗還需進(jìn)一步探索防止抗原降解、延長(zhǎng)抗原釋放、更有效提呈抗原的方法。

2.5菌影疫苗 菌影(bacterial ghost, BG)是無生命的細(xì)菌包膜復(fù)合物，具有良好的安全性，可攜帶多種蛋白質(zhì)或DNA編碼的抗原，可通過腸外、口服、鼻內(nèi)、陰道等多種途徑給藥，并可通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，具有固有的佐劑特性，其顆粒特性通過識(shí)別Toll樣受體或調(diào)理抗體促進(jìn)DC等免疫細(xì)胞的提呈和攝取功能。由于BG的來源以及免疫接種方式不同，BG疫苗大致可分為6類(表1)。重組BG作為一種新的傳遞載體，將目的基因或抗原轉(zhuǎn)化到合適的細(xì)菌上，使其在細(xì)胞的特定部位高表達(dá)，通過控制細(xì)胞的裂解產(chǎn)生BG。近年，Zhou P等研究表明，與裸DNA疫苗相比，以BG為載體，Cps MOMP與MIP聯(lián)合DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的免疫應(yīng)答，抗感染能力更強(qiáng)[56]。因此，菌影系統(tǒng)作為一種新的平臺(tái)技術(shù)，可用于靶向先進(jìn)藥物、新型微敏反應(yīng)器以及各種疫苗的研發(fā)等。

表1 菌影疫苗的分類

3 展 望

衣原體疫苗經(jīng)歷了全菌疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗等多種類型的疫苗，但是目前進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)期的衣原體疫苗卻屈指可數(shù)。安全、穩(wěn)定的亞單位疫苗與DNA疫苗、DC疫苗、BG疫苗的聯(lián)合免疫策略已經(jīng)成為近年研究的熱點(diǎn)，推動(dòng)衣原體疫苗的發(fā)展，但是目前衣原體疫苗研究還存在許多問題：①約85%的疫苗實(shí)驗(yàn)在替代宿主上進(jìn)行，不同宿主的安全性和免疫效果有所不同。②雖然目前常用的動(dòng)物模型，如小鼠、豚鼠、豬、考拉、人類非靈長(zhǎng)類的免疫反應(yīng)與人類非常相似，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)易存在倫理問題，如考拉的感染模型出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖問題。③疫苗免疫接種和攻毒方式不同，免疫效果也不同。在目前的研究中，免疫接種和攻毒方式大致分為粘膜接種與攻毒、系統(tǒng)性接種與粘膜攻毒、粘膜接種與系統(tǒng)性攻毒、系統(tǒng)性接種與攻毒以及混合接種與粘膜攻毒5種[57]。④生殖器衣原體引起人類天然免疫防御的機(jī)制尚不清楚，因?yàn)榕陨车廊狈Ω叨冉M織化的淋巴組織[24]?？傊?，開發(fā)人類可用的有效衣原體疫苗對(duì)于人類健康，特別是高危人群，以及人類公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展具有重要意義。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)新型技術(shù)的出現(xiàn)，大量潛在抗原和佐劑的進(jìn)一步評(píng)估，DNA疫苗、DC疫苗和BG疫苗等新型疫苗的深入研究，以及多種疫苗的聯(lián)合應(yīng)用，或許使最佳衣原體疫苗成為可能。

利益沖突：無