王大將，張夢(mèng)宇，岳正洋，周會(huì)玲*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

灰霉病是由一種壞死性和營(yíng)養(yǎng)性病原性真菌灰葡萄孢（Botrytis cinereaPers.）侵染所導(dǎo)致的病害，是植物中最普遍和最具破壞性的病害之一，可致使500多種植物發(fā)生病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]?；移咸焰咧饕：μO果的嫩莖、葉和果實(shí)[2]，可通過(guò)寄生在植物殘?bào)w內(nèi)或以菌核的形態(tài)在土壤深處度過(guò)寒冬等惡劣環(huán)境，具有極高的生存能力[3]，防治難度極大。目前防治灰霉病主要依靠使用化學(xué)殺菌劑，然而化學(xué)試劑的大量使用造成越來(lái)越多的食品安全和環(huán)境破壞等問(wèn)題，并且由于灰葡萄孢的遺傳靈活性和高進(jìn)化潛力，殺菌劑的效果常常會(huì)被大量具有抗藥性的田間灰葡萄孢菌株削弱[4-5]。因此，探究蘋果自身物質(zhì)對(duì)灰霉病的抗性是蘋果灰霉病防治的重要手段。綠原酸（chlorogenic acid，CGA）又稱3-O-咖啡?？崴幔怯煽Х人岬?位羧基和奎尼酸的3位羥基縮合成酯的天然產(chǎn)物[6]，具有抑菌消毒、活血降壓、抗氧化、防衰老等功效[7]，廣泛應(yīng)用于多個(gè)行業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，植物中提取的綠原酸對(duì)根霉、大腸桿菌、青霉菌均有較強(qiáng)的抑制作用[8]。Jiao Wenxiao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，水蜜桃果實(shí)經(jīng)綠原酸浸泡處理后接種擴(kuò)展青霉，其在25 ℃貯藏期間的損傷直徑和腐爛指數(shù)明顯降低，綠原酸處理對(duì)果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、pH值、可滴定酸含量等品質(zhì)指標(biāo)也有顯著的改善作用。除此之外，Vali?as等[10]研究馬鈴薯塊莖中的綠原酸合成途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，綠原酸及其衍生物可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基，減輕細(xì)胞膜脂的損傷和延緩細(xì)胞的衰老凋亡過(guò)程，提高植物的 抗病性[11]。作為蘋果中含量較高的酚類化合物，綠原酸能否作為外源誘導(dǎo)因素增強(qiáng)蘋果對(duì)灰霉病的抗性鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以‘富士’蘋果為研究對(duì)象，以外源綠原酸浸泡處理后損傷接種灰葡萄孢，通過(guò)分析蘋果發(fā)病過(guò)程中相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量的變化，探討綠原酸在采后蘋果灰霉病抗性中的作用，以期為綠原酸在采后蘋果灰霉病的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

富士蘋果（Malus domestica‘FuJi’）采于西北農(nóng)林科技大學(xué)白水蘋果試驗(yàn)站，要求大小均勻，成熟度、著色基本一致，且無(wú)病蟲害和機(jī)械損傷。

灰葡萄孢（Botrytis cinereaPer.）分離自感染灰霉病的蘋果果實(shí)，并進(jìn)行純化。將灰葡萄孢接種于PDA培養(yǎng)基中，并在25 ℃恒溫避光條件下培養(yǎng)7 d，用含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80的無(wú)菌水稀釋成105個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

L-苯丙氨酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 美國(guó)Sigma公司；綠原酸（純度98%） 上海源葉生物公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉、β-巰基乙醇、Tris-HCl、丙三醇、TritoX-100、磷酸、無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸羥胺、亮抑酶肽均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A11型液氮研磨儀 德國(guó)IKA公司；BSM-220.3電子 天平 上海卓精電子科技有限公司；Infinite M200pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；HH-6數(shù)顯恒溫水 浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接種實(shí)驗(yàn)

在含有綠原酸質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、100、200、300 μg/mL和500 μg/mL的PDA培養(yǎng)基上，分別接種20 μL 105個(gè)/mL灰葡萄孢懸浮液，放入培養(yǎng)箱中（25 ℃、黑暗）進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察記錄菌落直徑，根據(jù)菌落直徑篩選出合適的抑菌質(zhì)量濃度，重復(fù)3 次。

在離體實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，最終確定300 μg/mL為綠原酸的最佳抑菌質(zhì)量濃度。蘋果果實(shí)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液表面消毒后分為兩組，每組60 個(gè)果實(shí)，一組用綠原酸溶液浸泡30 min，另一組（對(duì)照組）用清水進(jìn)行相同處理，浸泡后取出在通風(fēng)條件下自然風(fēng)干，然后誘導(dǎo)24 h。用直徑3 mm消毒釘在蘋果赤道部位陰陽(yáng)兩面均勻刺2 個(gè)傷口（3 mm×3 mm），在傷口處分別接種20 μL 105個(gè)/mLB. cinerea懸浮液，晾干后覆上聚乙烯塑料薄膜（厚0.01 mm）保濕，貯藏于室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度85%～90%的條件下。對(duì)照組和處理組分別固定30 個(gè)果實(shí)，用于統(tǒng)計(jì)病斑直徑和發(fā)病率，重復(fù)3 次。其余果實(shí)定期（0、6、12、24、48、72、120、168 h和216 h）取病斑周圍1～2 cm內(nèi)健康果肉組織，用液氮迅速冷凍后磨成粉末，裝入錫箔紙袋中于-80 ℃保存，用于測(cè)定抗性相關(guān)代謝酶活力及活性物質(zhì)含量。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 發(fā)病率和病斑直徑測(cè)定

病斑直徑利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行十字交叉法測(cè)定，結(jié)果取平均值。蘋果病斑直徑不低于3.5 mm確定為發(fā)病，發(fā)病率按下式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2.2 幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活力測(cè)定

幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力分別參考袁仲玉[12]、曹建康[13]等的方法測(cè)定。稱取1 g果肉，加入5 mL pH 5.00.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（含1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和5 mmol/Lβ-巰基乙醇）冰浴研磨呈勻漿，離心（4 ℃、12000×g）后取上清液，即得到粗酶液。 以每分鐘每克鮮果肉中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9molN-乙酰葡萄糖胺為1 個(gè)CHI活力單位（U）；以37 ℃下每克鮮果肉每分鐘催化底物昆布多糖產(chǎn)生1 nmol的葡萄糖為1 個(gè)GLU活力單位（U）。CHI和GLU活力單位均 為U/（min·g）。

1.3.2.3 苯丙氨酸解氨酶活力測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力測(cè)定參考Han Cong等[14]的方法。稱取1.0 g果肉，加入2 mL 0.1 mol/L pH 8.7的硼酸提取緩沖液（含40 g/L PVP、2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、5 mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴條件下研磨成勻漿，4 ℃、12000×g離心30 min，取上清液，即得到粗酶提取液。以每小時(shí)每克鮮果肉組織酶促反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度增加0.01為1 個(gè)PAL活力單位（U），PAL活力單位 為U/（h·g）。

1.3.2.4 肉桂酸-4-羥化酶活力測(cè)定

肉桂酸-4-羥化酶（trans-cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）活力測(cè)定參考Liu Yaoyao等[15]的方法。稱取1.0 g果肉于研缽中，加入3 mL提取液（含50 mmol/L的Tris-HCl、15 mmol/Lβ-巰基乙醇、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L抗壞血酸、10 μmol/L亮抑酶肽、1 mmol/L PMSF、0.5 g/100 g PVP、體積分?jǐn)?shù)10%丙三醇），研磨至勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，得到上清液（粗酶液）。以每克鮮果肉組織酶促反應(yīng)體系在340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)C4H活力 單位（U），單位為U/（h·g）。

1.3.2.5 4-香豆酰輔酶A連接酶活力測(cè)定

4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）活力測(cè)定參照Takshak等[16]的方法并略有改動(dòng)。稱取1.0 g果肉于研缽中，加入2 mL提取液（含0.2 mol/L Tris-HCl、8 mmol/L MgCl2、2 g/100 mL PVP、5 mmol/L DTT、體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100、1 mmol/L PMSF）研磨至勻漿，于4 ℃、12000×g離心20 min，得到上清液（粗酶液）。以每分鐘每克鮮果肉組織于333 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)4CL活力單位（U），單位 為U/（min·g）。

1.3.2.6 總酚和類黃酮含量測(cè)定

總酚和類黃酮含量分別參考Toor[17]和González-Aguilar[18]等的方法測(cè)定。稱取1.0 g果肉，加入4 mL提取液（體積分?jǐn)?shù)為1% HCl-甲醇，4 ℃預(yù)冷），研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，在4 ℃下提取15 min，于4 ℃、12000×g離心30 min。取上清液分別在280 nm和325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，并以O(shè)D280nm和OD325nm分別表征總酚和類黃酮含量。

1.3.2.7 木質(zhì)素含量測(cè)定

按照周會(huì)玲等[19]的方法測(cè)定木質(zhì)素含量，以每克鮮果肉在280 nm波長(zhǎng)處的OD值表征木質(zhì)素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有指標(biāo)均平行測(cè)定3 次。以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，體外抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素分析進(jìn)行最小顯著性差異（least significance difference，LSD）分析，活體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對(duì)灰葡萄孢的體外抑制作用

圖 1 綠原酸處理對(duì)體外接種B. cinerea菌落的影響Fig. 1 Effect of chlorogenic acid treatment on B. cinerea colonies in vitro

菌落是微生物在固體培養(yǎng)基上以母細(xì)胞為中心生長(zhǎng)形成的肉眼可見(jiàn)子細(xì)胞集團(tuán)，其直徑是反映微生物生長(zhǎng)狀況的最直觀指標(biāo)。如圖1所示，以含有0、100、200、300、500 μg/mL綠原酸的PDA培養(yǎng)基接種B. cinerea，接種后72 h，各處理組病斑直徑均小于對(duì)照組，菌落的顏色變?yōu)樽攸S色，且隨著綠原酸質(zhì)量濃度增加，菌落顏色加深。接種后120 h各處理組病斑直徑也均小于對(duì)照組，并且顏色由72 h時(shí)的棕黃色變成黃褐色，但不同質(zhì)量濃度的綠原酸處理均未能完全抑制灰霉菌的生長(zhǎng)。可見(jiàn)，綠原酸雖然不能完全抑制B. cinerea的生長(zhǎng)，但與對(duì)照相比有抑制效果，并且能改變菌落的顏色，這可能是由于綠原酸處理影響了灰葡萄孢的正常生長(zhǎng)。

圖 2 綠原酸對(duì)體外接種B. cinerea菌落直徑的影響Fig. 2 Effect of chlorogenic acid treatment on the diameter of B. cinerea colonies in vitro

由圖2可知，在PDA培養(yǎng)基中，綠原酸質(zhì)量濃度在0～300 μg/mL范圍內(nèi)增加時(shí)，灰葡萄孢菌落直徑顯著降低， 但當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到500 μg/mL時(shí)，菌落直徑不發(fā)生顯著變化。因此，確定300 μg/mL為最佳抑菌質(zhì)量濃度，并將其作為本實(shí)驗(yàn)綠原酸的使用質(zhì)量濃度。

2.2 綠原酸對(duì)蘋果灰霉病的抑制作用

圖 3 綠原酸處理對(duì)蘋果灰霉病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 3 Effect of chlorogenic acid treatment on incidence (A) and lesion diameter (B) of gray mold on ‘Fuji’ apple fruit

發(fā)病率和病斑直徑是判斷發(fā)病情況的重要指標(biāo)。從圖3A可以看出，接種后24 h，處理組和對(duì)照組果實(shí)均有發(fā)病，但對(duì)照組的發(fā)病率為20%，而處理組只有6%，差異極顯著（P＜0.01）。此后對(duì)照組和處理組發(fā)病率均先迅速增加再緩慢增加，對(duì)照組和處理組分別在120、168 h時(shí)的發(fā)病率接近100%。由圖3B可以看出，對(duì)照組和處理組的病斑直徑在接種后72 h內(nèi)均比較低，兩組無(wú)顯著差異，120 h后兩組病斑直徑均迅速增加，但處理組病斑直徑顯著低于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）。圖4為蘋果灰霉病發(fā)病的外觀照片。綜上，綠原酸處理能有效抑制灰霉病病斑擴(kuò)展，從而減緩蘋果灰霉病的發(fā)生。

圖 4 綠原酸處理對(duì)蘋果灰霉病發(fā)病情況的影響Fig. 4 Effect of chlorogenic acid treatment on gray mold incidence on ‘Fuji’ apple fruit

2.3 綠原酸對(duì)蘋果果實(shí)CHI和GLU活力的影響

作為果實(shí)中重要的病程相關(guān)蛋白，CHI和GLU是受到病原菌侵染、機(jī)械損傷或環(huán)境脅迫等條件誘導(dǎo)寄主 產(chǎn)生防御反應(yīng)的重要物質(zhì)。由圖5A可知，接種灰葡萄孢后對(duì)照組和處理組CHI活力迅速增加，于48 h達(dá)到峰值，但此時(shí)處理組CHI活力比對(duì)照組高12.7%（P＜0.01）。隨后對(duì)照組和處理組CHI活力有所降低，但整個(gè)貯藏期間處理組的CHI活力均高于對(duì)照組。由圖5B可知，對(duì)照組和處理組在貯藏過(guò)程中GLU活力總體上都表現(xiàn)出先增加再減小然后又增加的趨勢(shì)，但處理組GLU活力整體上高于對(duì)照組。接種灰葡萄孢后，處理組GLU活力迅速增加，6 h時(shí)即達(dá)到較高水平，而對(duì)照組GLU活力前期增加不明顯。兩組GLU活力都在72 h達(dá)到峰值，但此時(shí)處理組GLU活力極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，綠原酸處理可顯著提高CHI和GLU活力，從而增強(qiáng)對(duì)病原菌的抑制作用，提高果實(shí)的抗病力。

圖 5 綠原酸對(duì)接種灰葡萄孢后蘋果CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig. 5 Effect of chlorogenic acid on the activities of chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B) in ‘Fuji’ apple fruit

2.4 綠原酸處理對(duì)苯丙烷代謝相關(guān)酶活力的影響

PAL與植物體內(nèi)許多抗菌物質(zhì)的生成密切相關(guān)，其活力是表征植物抗性的重要指標(biāo)之一。如圖6A所示，整個(gè)貯藏過(guò)程中，處理組果實(shí)PAL活力均高于對(duì)照組，且兩組PAL活力變化總體上都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。接種灰葡萄孢之后，處理組果實(shí)PAL活力迅速增加，在24 h即達(dá)到峰值，此時(shí)處理組PAL活力比對(duì)照組高6.7%（P＜0.01）。對(duì)照組果實(shí)PAL活力增長(zhǎng)較慢，48 h才達(dá)到活力峰值。在貯藏末期，對(duì)照組PAL活力仍有升高的趨勢(shì)，而處理組PAL活力開(kāi)始降低，但處理組PAL活力高于對(duì)照組。

由圖6B可知，接種灰葡萄孢之后，對(duì)照組和處理組C4H活力總體上都表現(xiàn)出先升高后降低然后再升高的趨勢(shì)，且處理組C4H活力均高于對(duì)照組。兩組C4H的活力都在12 h達(dá)到峰值，但此時(shí)處理組C4H活力比對(duì)照組 高15.4%（P＜0.01）。顯然，C4H在蘋果抵御灰霉病的抗性反應(yīng)中產(chǎn)生了響應(yīng)，且綠原酸處理對(duì)這一過(guò)程有促進(jìn)作用。

圖 6 綠原酸處理對(duì)接種灰葡萄孢后蘋果抗性相關(guān)酶活力的影響Fig. 6 Effect of chlorogenic acid treatment on the activities of gray mold disease resistance-related enzymes in ‘Fuji’ apple fruit

4CL是總酚、類黃酮、木質(zhì)素等與抗性相關(guān)物質(zhì)合成過(guò)程中一種關(guān)鍵性的限速酶，其活力常作為表征植物抗病性的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖6C可知，整個(gè)貯藏期間處理組果實(shí)4CL活力出現(xiàn)2 個(gè)峰值，而對(duì)照組4CL活力則表現(xiàn)出波動(dòng)的變化趨勢(shì)，且無(wú)明顯的活力峰，并且處理組4CL活力始終高于對(duì)照組。處理組果實(shí)在接種灰葡萄孢后12 h時(shí)的4CL活力與對(duì)照組差異最大，比對(duì)照組高43.2%（P＜0.01）。48 h之后兩組4CL活力之間的差異雖然不顯著，但處理組4CL活力仍高于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，外源綠原酸處理可以提高4CL活力，且影響作用在接種后初期更為明顯。

2.5 綠原酸處理對(duì)苯丙烷代謝途徑次生物含量的影響

總酚和類黃酮是植物體內(nèi)的直接抑菌物質(zhì)，其含量與植物抗病能力密切相關(guān)。由圖7A可知，整個(gè)貯藏過(guò)程中，處理組蘋果果實(shí)總酚含量高于對(duì)照組。接種灰葡萄孢后對(duì)照組和處理組總酚含量均迅速增加，但貯藏初期兩組總酚含量差異并不顯著。隨著病害的發(fā)展，兩組 果實(shí)中總酚含量差異逐漸增大，到24 h時(shí)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），此時(shí)處理組總酚含量比對(duì)照組高40%。接種24 h后，兩組總酚含量都開(kāi)始緩慢減少，但216 h時(shí)但處理組總酚含量仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖 7 綠原酸處理對(duì)蘋果灰霉病抗性相關(guān)物質(zhì)含量的影響Fig. 7 Effect of chlorogenic acid treatment on the contents of gray mold resistance-related substances in ‘Fuji’ apple fruit

由圖7B可知，整個(gè)貯藏過(guò)程中，處理組類黃酮含量均高于對(duì)照組。接種灰葡萄孢之后處理組類黃酮含量迅速增加，在12 h達(dá)到峰值，此時(shí)比對(duì)照組類黃酮含量高25%（P＜0.01）。12 h后處理組類黃酮含量出現(xiàn)一個(gè)短暫的降低過(guò)程，但隨后又開(kāi)始升高，并且直到貯藏末期，處理組類黃酮含量仍極顯著高于對(duì)照組 （P＜0.01）?？梢?jiàn)，與對(duì)照組相比，綠原酸處理可以明顯提高蘋果對(duì)灰霉病的抗性反應(yīng)過(guò)程中類黃酮的含量。

木質(zhì)素可以強(qiáng)固細(xì)胞壁和增加抗性，是植物抗性系統(tǒng)的重要組成部分。由圖7C可知，接種灰葡萄孢后，處理組木質(zhì)素含量迅速增加，于72 h達(dá)到最高，此后有所降低，而對(duì)照組的木質(zhì)素含量上升比較緩慢，120 h達(dá)到最高，之后處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。但整個(gè)過(guò)程處理組木質(zhì)素含量明顯高于對(duì)照組。可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，綠原酸處理可以使蘋果在抵抗灰霉病的抗性反應(yīng)過(guò)程中積累更多的木質(zhì)素。

3 討 論

綠原酸是植物體內(nèi)普遍存在的一種與抗性密切相關(guān)的酚酸類物質(zhì)[20]。研究表明，抗病性強(qiáng)的蘋果品種含有的綠原酸較多，且在受到病原菌侵染后，其綠原酸增加量顯著高于抗性低的蘋果品種[21]。李珊珊等[22]研究表明，綠原酸對(duì)西瓜枯萎病菌有較強(qiáng)的離體抑制作用，且隨著濃度的升高，其抑菌活性呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸處理能明顯降低蘋果灰霉病發(fā)病率，抑制病斑直徑，且在接種前期表現(xiàn)較為突出。可能是由于前期用綠原酸浸泡處理導(dǎo)致部分綠原酸滲入果實(shí)內(nèi)部，從而對(duì)灰葡萄菌產(chǎn)生直接抑制作用，因此在接種后24 h，處理組的發(fā)病率與對(duì)照組有極顯著差異 （P＜0.01），此時(shí)處理組病斑直徑也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著綠原酸在果實(shí)內(nèi)部被代謝，其濃度逐漸降低，處理組發(fā)病率與對(duì)照組差異逐漸縮小。發(fā)病末期，處理組病斑直徑顯著低于對(duì)照組，可能是由于外源綠原酸處理提高了果實(shí)自身抗病能力，從而抑制了病斑擴(kuò)散情況。

植物體內(nèi)的CHI和GLU在抵御病原菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)中主要起細(xì)胞壁水解酶的作用[23]。Schlumbaum等[24]研究發(fā)現(xiàn)，菜豆積累的CHI經(jīng)過(guò)提純后，在體外能夠明顯抑制綠色木霉（Trichoderm viride）菌絲的生長(zhǎng)。正常情況下，CHI和GLU主要分布于植物細(xì)胞液泡內(nèi)，細(xì)胞間隙中相對(duì)較少[12]，且活性很低，當(dāng)病原菌侵染植物后會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損害，從而誘導(dǎo)CHI和GLU活性升高[25]。本實(shí)驗(yàn)中，接種灰葡萄孢后，處理組CHI和GLU活力迅速增加，且在整個(gè)貯藏期間均大于對(duì)照組，有效提高了蘋果的灰葡萄孢抗性，與袁仲玉[12]、周曉婉[26]等利用1-甲基環(huán)丙烯、蘆薈粗提物誘導(dǎo)蘋果灰霉病抗性的結(jié)果一致。

苯丙烷代謝是植物抗病反應(yīng)中重要的代謝途徑之一。PAL是苯丙烷代謝途徑中第一個(gè)催化產(chǎn)生酚類的酶，可催化苯丙氨酸生成肉桂酸，對(duì)酚類、植物抗毒素和木質(zhì)素的生物合成具有調(diào)節(jié)作用[27]。C4H可以催化肉桂酸生成4-香豆酸，是苯丙烷代謝途徑中重要的節(jié)點(diǎn)酶之一[28]。4CL催化對(duì)香豆酸形成的對(duì)香豆酸輔酶A是多個(gè)重要代謝分支的前體物質(zhì)，可進(jìn)一步合成綠原酸等酚酸類，也可在查耳酮合成酶的催化下形成查耳酮和根皮苷等類黃酮類[29]。PAL、C4H和4CL作為苯丙烷代謝途徑上游的幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)酶，負(fù)責(zé)催化多種物質(zhì)的合成[30]， 為整個(gè)代謝途徑的眾多下游分支提供前體物質(zhì)，其活性與植物的抗性密切相關(guān)。經(jīng)外源綠原酸處理的果實(shí)在接種灰葡萄孢后，PAL、C4H、4CL活力迅速升高，在很短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高水平，可以更快地積累與抗病性相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物，從而提高果實(shí)的抗病性。

作為苯丙烷途徑的次生代謝產(chǎn)物，總酚和類黃酮具有殺菌、抗病毒、清除自由基等多種與植物抗病性相關(guān)的生物活性[31]。Deng Jianjun[32]和Li Guangjin[33]等研究發(fā)現(xiàn)，苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活性的增加可以促進(jìn)總酚、類黃酮的積累，從而增強(qiáng)桃、甜瓜對(duì)病原菌的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，PAL、C4H、4CL活力升高的同時(shí)，總酚、類黃酮含量也增加，綠原酸處理組果實(shí)中總酚和類黃酮含量明顯高于對(duì)照組，這與Terry等[34]的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中，接種灰葡萄孢后，綠原酸處理組和對(duì)照組木質(zhì)素含量都明顯增加，但處理組木質(zhì)素含量增加更多。木質(zhì)素可以與細(xì)胞壁多糖、細(xì)胞壁蛋白結(jié)合，增厚細(xì)胞壁形成機(jī)械屏障，阻止病原菌侵入及其在植物體內(nèi)的擴(kuò)展[35]。

綜上，與對(duì)照相比，外源綠原酸處理可以明顯提高果實(shí)中CHI和GLU活性，抑制灰葡萄孢的生長(zhǎng)，同時(shí)提高苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL等關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累，從而提高果實(shí)的抗病性，有效改善接種果實(shí)發(fā)病情況。