劉夢(mèng)蝶，姜慧雯，李 潔,2,3,*，嚴(yán)守雷,2,3，王清章,2,3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070； 3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國重要的水生經(jīng)濟(jì)作物，深受國內(nèi)外眾多消費(fèi)者青睞。蓮藕在長期貯藏以及運(yùn)輸中容易發(fā)生腐爛，腐爛是僅次于褐變的影響蓮藕品質(zhì)的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是蓮藕采后的主要腐敗菌[1]。

空氣放電技術(shù)是將風(fēng)機(jī)送入的空氣在高壓靜電處理下，通過一系列復(fù)雜的電離和結(jié)合過程，產(chǎn)生放電生成氣的過程，主要生成臭氧（ozone，O3）和負(fù)離子（包括O2-、O3-、H2O-等）。用一定濃度的放電生成氣對(duì)果品的貯藏環(huán)境進(jìn)行處理，能夠抑制果實(shí)呼吸強(qiáng)度和微生物生長，有助于果蔬的保藏[2]。

凋亡是由高度進(jìn)化后基因調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡過程，普遍存在于動(dòng)物、植物以及微生物中，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，衰老和分化等過程具有重要作用[3-6]。絲狀真菌在生長的各個(gè)階段經(jīng)常會(huì)有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，如異核體不親和和菌絲自溶，另外多種脅迫因子如紫外線、滲透壓、抗真菌藥物等均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。很多學(xué)者以酵母凋亡通路為例，研究外界刺激下絲狀真菌凋亡特征事件發(fā)生的次序及關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄紅素可以誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌菌絲凋亡，凋亡細(xì)胞具有DNA斷裂、線粒體膜去極化和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）累積等特征[7]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明空氣放電處理能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞活力及其超微結(jié)構(gòu)、生理代謝和細(xì)胞膜等方面產(chǎn)生影響，達(dá)到抑菌作用[2,8-9]。本研究將從空氣放電處理誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡過程中的各種現(xiàn)象及可能存在的凋亡機(jī)制方面出發(fā)，進(jìn)一步完善空氣放電處理抑菌機(jī)理，為空氣放電技術(shù)對(duì)果品腐敗的抑制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

尖孢鐮刀菌為蓮藕貯藏期病原菌，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、DCFH-DA ROS檢測試劑盒、Fluo-3 AM熒光探針 上海碧云天生物技術(shù)有限 公司；Rho123線粒體膜電位檢測試劑盒 上海貝博生物科技有限公司；Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針 美國AAT Bioquest公司；CaspACE FITC-VAD-FMK染液 美國 Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MIC-O3臭氧變送器 深圳市藍(lán)月測控技術(shù)有限 公司；QT2SVP500一體化臭氧發(fā)生器 深圳市松野電器有限公司；TFB-YA278負(fù)離子發(fā)生器 天長市創(chuàng)普電子有限公司；Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀 美國Merck Millipore公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀 美國Becton Dicknson公司；F-4600熒光分光光度計(jì) 日本HITACHI公司；ECLIPSE Ti-S倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 尖孢鐮刀菌的空氣放電處理

F. oxysporum接種于PDA平板上，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。密閉空氣放電設(shè)備內(nèi)臭氧和負(fù)離子生成氣達(dá)到設(shè)定濃度后將平板分別放入臭氧（6.87 mg/m3）、負(fù)離子（5×106ions/cm3）、臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理 （6.87 mg/m3+5×106ions/cm3）環(huán)境中，分別處理1、2、3、4、5 h，以不做任何處理為對(duì)照，向每個(gè)平板中加入1.5 mL無菌水，將其產(chǎn)生的分生孢子用無菌水潤洗至試管，然后離心（4 ℃、1000 ×g、5 min）收集孢子。

1.3.2 尖孢鐮刀菌孢子的凋亡雙染

用0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸1.3.1節(jié)得到的孢子并計(jì)數(shù)，取10 μL孢子懸液用190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸洗滌，使孢子密度約1×106個(gè)/mL，加入用PBS稀釋10 倍后的Annexin V-FITC染色液5 μL，1 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液輕輕混勻，避光孵育20 min，采用FACSVerse流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.3 尖孢鐮刀菌孢子ROS含量測定

按照1∶1000體積比用PBS稀釋熒光探針DCFH-DA至濃度為10 μmol/mL。取洗滌后的孢子，重懸于稀釋好的500 μL DCFH-DA中，孢子密度約1×106個(gè)/mL，室溫避光孵育1 h。PBS洗滌后，用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比，故以熒光強(qiáng)度表征孢子ROS含量。

1.3.4 尖孢鐮刀菌孢子膜電位的測定

按照Rho123線粒體膜電位檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液及Rho123染色工作液（質(zhì)量濃度50 μg/mL）。用500 μL Rho123染色工作液將孢子重懸，孢子密度約1×106個(gè)/mL，室溫避光孵育30 min，洗滌離心（4 ℃、3000×g、5 min）收集孢子，用500 μL染色緩沖液將孢子重懸，用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以熒光強(qiáng)度表征膜電位，熒光強(qiáng)度越大，膜電位越高。

1.3.5 尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的測定

Fluo-3 AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fluo-3 AM 的熒光非常弱，其熒光不會(huì)隨Ca2+濃度升高而增強(qiáng)。Fluo-3 AM 進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3， 從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3可以和Ca2+結(jié)合，且結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。

按照1∶10000體積比用PBS稀釋熒光探針Fluo-3 AM， 使終濃度為0.5 μmol/L。取30 μL收集的孢子懸液，重懸于稀釋好的200 μL Fluo-3 AM溶液中，孢子密度約2.5×106個(gè)/mL，室溫避光孵育50 min進(jìn)行熒光探針裝載，PBS洗滌兩次（4 ℃、3000×g、5 min），再孵育20 min后用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀檢測[10]，以熒光強(qiáng)度表征Ca2+濃度，熒光強(qiáng)度越大，胞漿Ca2+濃度越高。

1.3.6 尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的測定

Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針是一種Rhod-2的乙酰甲酯衍生物，進(jìn)入細(xì)胞后被內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，負(fù)載到細(xì)胞內(nèi)。Rhod-2是一種可見光激發(fā)的高親和力Ca2+指示劑，能有效地將鈣熒光信號(hào)增加幾十倍。Rhod-2具有很強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+濃度變化，從而降低了對(duì)活細(xì)胞的光毒性；由于產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度具有很強(qiáng)的Ca2+依賴性，對(duì)Ca2+濃度檢測的敏感度也更高，故以熒光強(qiáng)度表征Ca2+濃度。

利用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解Rhod-2 AM配制成質(zhì)量濃度2 mg/mL的儲(chǔ)存液，分裝后于-20 ℃避光干燥密封保存，在使用前回溫至室溫，用PBS稀釋到質(zhì)量濃度5 μg/mL。用稀釋好的300 μL Rhod-2 AM染色液重懸收集的孢子，使孢子濃度約為1×107個(gè)/mL。 室溫避光孵育40 min，PBS洗滌細(xì)胞兩次（4 ℃、3000×g、5 min），加入PBS緩沖液1.5 mL再室溫避光孵育30 min后用熒光分光光度計(jì)檢測。激發(fā)波長550 nm、發(fā)射波長580 nm[11]。

1.3.7 尖孢鐮刀菌孢子半胱天冬氨酸酶（metacaspase）激活的檢測

收集臭氧（6.87 mg/m3）、負(fù)離子（5×106ions/cm3）、 臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理（6.87 mg/m3+5×106ions/cm3） 條件下處理5 h的分生孢子，懸浮在用PBS稀釋的CaspACE FITC-VAD-FMK （10 μmol/L）染液中，室溫避光孵育2 h，PBS洗滌一次（4 ℃、3000×g、5 min）后重懸，取適量在熒光顯微鏡下觀察染色情況[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)用Data Processing System 7.05軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，流式細(xì)胞儀圖像由Flowjo 7.6軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣放電處理誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡

圖 1 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子FITC/PI雙染凋亡分析Fig. 1 Annexin V-FITC/PI double-staining analysis of apoptosis in F. oxysporum spores after air discharge treatment

如圖1所示，隨著處理時(shí)間的延長，負(fù)離子處理組早期孢子凋亡數(shù)（Q3）增多，處理5 h時(shí)，早期孢子凋亡比率從6.43%增加至28.3%，而晚期孢子凋亡數(shù)（Q2）和壞死數(shù)（Q1）基本無變化。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組早/晚期孢子凋亡數(shù)和壞死數(shù)都明顯增加，且在每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組孢子壞死數(shù)都明顯占優(yōu)勢。

圖 2 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子的凋亡率和壞死率Fig. 2 Apoptosis and necrosis rates of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖2所示，負(fù)離子處理組和臭氧處理組孢子凋亡率隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)遞增趨勢，臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組孢子壞死率均在處理2 h時(shí)達(dá)到最大。臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理1 h時(shí)，尖孢鐮刀菌孢子已表現(xiàn)出明顯壞死，壞死率明顯高于臭氧單獨(dú)處理。說明空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子存在誘導(dǎo)凋亡和壞死雙重作用。

2.2 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子ROS含量的影響

如圖3所示，空氣放電處理后，尖孢鐮刀菌孢子ROS含量增加，在處理過程中，臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組ROS含量均顯著高于負(fù)離子處理組 （P＜0.05）。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組在處理2 h內(nèi)ROS明顯上升，隨后上升趨勢減緩。而負(fù)離子單獨(dú)處理組在前3 h內(nèi)ROS含量無明顯變化，處理4 h后ROS含量明顯升高。

圖 3 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子ROS積累的影響Fig. 3 ROS accumulation in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

2.3 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響

圖 4 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響Fig. 4 Detection of Δψm in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖4所示，隨著空氣放電處理時(shí)間的延長，孢子內(nèi)線粒體膜電位逐漸下降。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組在處理2 h內(nèi)下降趨勢明顯，負(fù)離子處理組在處理1 h內(nèi)下降趨勢明顯，在處理2 h后臭氧處理組和 臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組線粒體膜電位明顯低于負(fù)離子處理組（P＜0.05）。

2.4 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的影響

圖 5 空氣放電處理尖孢鐮刀菌Fluo-3 AM染色細(xì)胞分布直方圖Fig. 5 Fluo-3 AM stained cell distribution of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

從染色細(xì)胞分布直方圖（圖5）中可以看出，隨著處理時(shí)間的延長，相較于臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組，負(fù)離子處理組染色細(xì)胞數(shù)變化不明顯。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組染色細(xì)胞比率均在處理1 h達(dá)到最大值，分別為34.5%和44.8%。

圖 6 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2＋濃度的影響Fig. 6 Cytosolic Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖6所示，隨著處理時(shí)間的延長，相較于負(fù)離子處理組尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度緩慢上升，臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組Ca2+濃度在處理1 h時(shí)達(dá)到峰值，在處理2 h后有所下降，維持相對(duì)穩(wěn)定的水平。不同處理組在各處理時(shí)間都有顯著性差異（P＜0.05），其中臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理胞漿Ca2+濃度最高，其次是臭氧處理，負(fù)離子處理最低。

2.5 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的影響

圖 7 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2＋濃度的影響Fig. 7 Mitochondrial Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

如圖7所示，隨著處理時(shí)間的延長，負(fù)離子處理組尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度緩慢上升，而臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組Ca2+濃度在處理1 h時(shí)已大幅度升高，之后減幅穩(wěn)定上升。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組與負(fù)離子處理組在各處理時(shí)間都有顯著性差異（P＜0.05），處理4 h后臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組與臭氧處理組有顯著性差異（P＜0.05）。

在處理1 h時(shí)，臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組胞漿（圖6）及線粒體Ca2+濃度（圖7）均顯著升高 （P＜0.05），而處理時(shí)間延長時(shí)，孢子內(nèi)胞漿Ca2+濃度下降，線粒體Ca2+濃度繼續(xù)上升，可以推斷存在胞漿 Ca2+內(nèi)流入線粒體。

2.6 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase 活力的影響

Metacaspase是一類存在于真菌、植物及原生生物中的半胱氨酸依賴蛋白酶，與動(dòng)物細(xì)胞中胱天蛋白酶（caspase）家族具有直接同源性，通過細(xì)胞內(nèi)ROS的積累和線粒體功能的損傷對(duì)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用[6,13-15]。 Z-VAD-FMK是一種廣泛的Caspase抑制劑，可以使用FITC-VAD-FMK（Z-VAD-FMK的FITC綴合物）檢測Metacaspase活力，該FITC綴合物被遞送到細(xì)胞中，與凋亡細(xì)胞中活化的Caspase特異性結(jié)合，產(chǎn)生熒光[16-18]。

如圖8所示，3 種處理組中部分細(xì)胞顯示出明顯的綠色熒光，而對(duì)照組未觀察到熒光，其中臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組染色細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度明顯高于負(fù)離子處理組。表明空氣放電處理后，尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase活力明顯增強(qiáng)。

圖 8 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase活力的影響Fig. 8 Effect of air discharge on the activity of metacaspase in F. oxysporum spores

3 討 論

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵分子信號(hào)為ROS和Ca2+[19-20]。 細(xì)胞Ca2+超載或胞內(nèi)Ca2+區(qū)域化分布的擾動(dòng)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性并能引發(fā)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，胞漿內(nèi)增多的Ca2+可促使ROS過量產(chǎn)生而引起膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜及線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，激活內(nèi)源性核酸酶等多種酶，引起核DNA降解而誘導(dǎo)凋亡 發(fā)生[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中空氣放電處理后胞漿和線粒體內(nèi) Ca2+濃度均迅速上升，因此，推測Ca2+超載是空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡的原因之一。這與沈青山[24]的 研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚是通過激活電壓門控鉀離子通道導(dǎo)致K+外流，最終導(dǎo)致黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡不同。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，對(duì)細(xì)胞凋亡起到了關(guān)鍵作用[25]，是ROS產(chǎn)生的主要來源[26]。ROS在凋亡過程作為非常重要的信號(hào)和效應(yīng)器，其積累可導(dǎo)致孢子內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)損傷，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)凋亡 發(fā)生[27-28]。侯穎等[29]研究了不同致死濃度ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）對(duì)釀酒酵母細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，結(jié)果表明ε-PL能夠誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞ROS迸發(fā)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段。Savi等[30]在研究臭氧氣體破壞禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和輪枝鐮孢菌 （F. verticillioides）菌絲形態(tài)造成細(xì)胞死亡的原因之一是細(xì)胞內(nèi)ROS的異常產(chǎn)生積累，推斷存在細(xì)胞凋亡。ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷已被證明是念珠菌屬真菌常見的抗真菌機(jī)制，也有少量研究集中在一些絲狀真菌如曲霉菌[31]、絲核菌[32]和鐮刀菌[33]中。

在多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡期間，線粒體膜電位的崩解是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要事件，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的結(jié)果[34]；劉晶[35]以H2O2作為氧化損傷刺激物，研究從3 種乳酸桿菌中分離的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的線粒體凋亡通路的影響，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS過度觸發(fā)引起線粒體膜電位的下降，并且3 種菌株的S-層蛋白能顯著地降低HT-29細(xì)胞的線粒體膜電位。這種破壞造成線粒體膜孔的打開，導(dǎo)致凋亡因子和細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）從線粒體釋放到胞質(zhì)[36-37]。Cyt c是位于線粒體膜間隙的一種血紅素蛋白質(zhì)，不僅在線粒體呼吸鏈中起重要作用，在復(fù)合酶III和復(fù)合酶IV之間傳遞電子，也作為一種多功能蛋白酶參與細(xì)胞的生長和凋亡[38]。細(xì)胞凋亡進(jìn)程中下游Caspase的激活必須經(jīng)由Cyt c與Caspase的結(jié)合[39]。Metacaspase是Caspase的同系物，被認(rèn)定是存在于真菌、植物和原生生物凋亡過程中的引發(fā)物[18]。在真菌中，細(xì)胞凋亡途徑有Metacaspase獨(dú)立型和依賴型兩種[40]，本實(shí)驗(yàn)表明空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌凋亡過程中會(huì)引起Metacaspase的激活，屬于Metacaspase依賴型；而毛霉素VI誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌凋亡過程中，Metacaspase未激活[41]，屬于Metacaspase獨(dú)立型。

綜上研究結(jié)果表明，空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子的凋亡過程是以線粒體為核心的凋亡機(jī)制，即空氣放電首先引起胞內(nèi)Ca2+濃度的增加和ROS的積累，線粒體膜電位的去極化由線粒體ROS的產(chǎn)生引起，導(dǎo)致Cyt c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活Metacaspase，最終導(dǎo)致孢子凋亡。