傅 恒，王麗娜，楊月美，郭 帥，姚 欣

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內(nèi)的常見病和多發(fā)病，目前發(fā)病率仍有不斷上升趨勢［1］。過敏性哮喘作為最常見哮喘類型，由Th2 型細(xì)胞因子［白細(xì)胞介素（interleukin，IL）?4、5 和13］驅(qū)動(dòng)，血嗜酸性粒細(xì)胞增多和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）升高是其主要臨床特征［2］。

最近一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome?wide asso?ciation studies，GWAS）發(fā)現(xiàn)，過敏性哮喘的發(fā)生與整合素樣金屬蛋白酶15（a disintegrin and metallopro?teinase 15，ADAM15）基因密切相關(guān)［3］，高度提示AD?AM15 在哮喘疾病中起重要作用，但其機(jī)制尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)ADAM15 可使B 細(xì)胞釋放促進(jìn)IgE 合成的可溶性CD23（sCD23），是一種潛在的內(nèi)源性IgE 調(diào)節(jié)劑［4］?；贗gE 在哮喘中的關(guān)鍵作用，本文推測，ADAM15可能通過促進(jìn)IgE 合成，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究擬在人體、動(dòng)物和細(xì)胞水平研究哮喘過程中ADAM15 表達(dá)及分布，并探討其與IgE 的相關(guān)性及可能調(diào)控機(jī)制，了解其在哮喘形成中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象

納入2018年6月—2020年4月就診于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診的支氣管哮喘患者32 例，所有病例均依據(jù)2018 年全球哮喘防治倡議（Global Initiative For Asthma，GINA）的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。同期收集16 例健康志愿者作為正常對照組，受試者均簽署知情同意書，并通過南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)許可。兩組人群均無吸煙者，通過卡方檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，性別、年齡無明顯差異：①性別（男/女），對照（3/13）vs.哮喘（8/24）（P=0.627）；②年齡（歲），對照（48.19±1.89）vs.哮喘（42.44±2.82）（P=0.180）。

SPF級雌性6～8周BALB/c小鼠10只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按規(guī)范嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料和血清標(biāo)本收集

入組時(shí)收集受試者臨床信息（包括一般情況、病史和既往史等），用含分離膠/促凝劑的真空采血管分別采集晨起空腹外周靜脈血5 mL，對其外周血行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。余外周血室溫靜置20 min，以3 000 r/min、4 ℃離心10 min，獲得上層血清，檢測受試者血清ADAM15和總IgE水平。

1.2.2 哮喘小鼠模型構(gòu)建

隨機(jī)將動(dòng)物分為兩組：對照組（n=5）和哮喘組（n=5），分別于第0、7、14天致敏哮喘組小鼠，腹腔內(nèi)注射雞卵清蛋白（OVA）+氫氧化鋁的混懸液4 mL/kg，對照組小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水4 mL/kg；分別于第20、21、22 天激發(fā)哮喘組小鼠，采用濃度為4 mg/mL的OVA 溶液滴鼻20 μL，對照組小鼠生理鹽水滴鼻20 μL。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immuno?sorbent assay，ELISA）

采用人ADAM15 ELISA 檢測試劑盒（SEKH?0078，北京索萊寶科技有限公司）說明書進(jìn)行，將待測血清和試劑室溫平衡30 min，洗板3次并甩干，加樣（標(biāo)準(zhǔn)品及樣本）100 μL至ELISA板內(nèi)，37 ℃烘箱孵育90 min，洗板4次，洗板后加100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃烘箱孵育1 h，洗板4次，再加100 μL酶結(jié)合工作液，于37 ℃烘箱孵育30 min，洗板5 次，加入顯色底物100 μL，37 ℃烘箱避光孵育15 min，待標(biāo)準(zhǔn)孔藍(lán)色深度合適時(shí)，加50 μL終止液，放置于酶標(biāo)儀中450 nm波長檢測每孔光密度值。

1.2.4 免疫組化

最后一次OVA激發(fā)后24 h處理小鼠，取每只小鼠右下肺最大橫徑處肺組織，采用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片。石蠟切片置于烘箱脫蠟60 ℃烘2 h，依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ浸泡切片15 min，后梯度浸泡于100%、95%、90%、80%、60%的乙醇各3 min，最后用PBS浸洗2次，每次3 min。置于含檸檬酸緩沖液的高壓鍋中，沸水修復(fù)2 min，冷卻至室溫后，用PBS沖洗2次，每次5 min。室溫將切片置于3%H2O2溶液15 min 以滅活內(nèi)源性酶，PBS 沖洗3 次，每次5 min。吸去組織周圍液體，油筆畫圈，10%山羊血清室溫封閉1 h，PBST沖洗3次，每次5 min。滴加ADAM15抗體（K008285P，北京索萊寶科技有限公司），4 ℃濕盒過夜。第2 天，甩去一抗稀釋液，PBST 沖洗3 次，每次5 min。每個(gè)圈內(nèi)組織滴加100 μL生物素標(biāo)記的二抗（1∶500 稀釋）室溫孵育1 h，PBST 沖洗3 次，每次5 min。每個(gè)圈內(nèi)組織滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50 μL，在顯微鏡下觀察顯色情況，染色好后用蒸餾水洗滌。蘇木素30 s染核，立即蒸餾水洗滌，1%鹽酸酒精分化，溫水反藍(lán)。梯度60%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水，每次3 min；二甲苯Ⅱ、Ⅰ依次浸泡3 min。最后采用中性樹脂封片，蓋玻片固定后在顯微鏡下觀察。

1.2.5 人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）培養(yǎng)

用含10%胎牛血清（Gibco公司，美國）、1%雙抗的RPMI1640（Gibco 公司，美國）培養(yǎng)基培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞株16 HBE（北京腫瘤研究所），放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。隔日換液、待細(xì)胞長至90%時(shí)胰酶消化、傳代，布板至6孔板和12孔板，待細(xì)胞長至密度80%時(shí)用無血清的1640培養(yǎng)基饑餓6～12 h。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR

待細(xì)胞布板至12 孔板并饑餓6?8 h 后，用人源性重組細(xì)胞因子IL?4（BK0245，Bioworld 公司，美國）、IL?13（213?ILB/CF，R&D 公司，美國）、IL?17（BK0234，Bioworld 公司，美國）、TNF?α（PR1125，Bioworld公司，美國）分別刺激16HBE 12、24 h，以不加干預(yù)措施的細(xì)胞為對照組。移去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞后，每孔加入1 mL TRIzol（TaKaRa 公司，日本）以提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后加入SYBR Green 后進(jìn)行RT?PCR 實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃30 s→變性95 ℃5 s→退火60 ℃30 s→延伸72 ℃10 min，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算2-△△CT值，最后比較目的基因在細(xì)胞中的相對表達(dá)量。所用引物委托南京Re?algene 公司合成：人GAPDH 上游引物 5′ ?AGAAGGCTGGGGCT?CATTTG?3′；下游引物5′?AGGGGCCATCCACAGTC?TTC?3′；人ADAM15 上游引物5′?CAGGACGATCTCCCAATTAGC?3′；下游引物5′?GGACCAACTCCCTATTCTGTAGC?3′。

1.2.7 Western blot

細(xì)胞布板至6孔板并饑餓6～8 h，以人源重組細(xì)胞因子IL?13（10 ng/mL）（213?ILB/CF，R&D 公司，美國）刺激16HBE 24 h，經(jīng)PBS 洗3 次，用蛋白裂解液提取總蛋白，并用BCA法測得蛋白含量。蛋白提取完成后制備SDS?聚丙烯酰胺凝膠，采用80/120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%BSA洗滌緩沖液室溫封閉2 h，加入β?actin 抗體（T0022，Affinity 公司，美國）及ADAM15 抗體（K008285P，北京索萊寶科技有限公司）4 ℃冰箱孵育過夜，第2 天采用TBST 洗滌緩沖液洗滌后，用鼠抗兔二抗（sc?2357，Santa Cruz 公司，美國）室溫1 h。使用Molecu?lar Imager ChemiDocTMXRS+數(shù)字成像系統(tǒng)，用電化學(xué)曝光液成像，以β?actin 為內(nèi)參，比較ADAM15 的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（）表示，兩組資料間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料之間的比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘患者血清中ADAM15表達(dá)升高

對32 例哮喘患者和16例健康對照者血清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明，與健康對照者相比，哮喘患者血清中的ADAM15水平增高［（749.5±132.3）pg/mLvs.（398.90±22.13）pg/mL］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023，圖1）。

圖1 哮喘患者與健康對照組血清ADAM15的表達(dá)Figure 1 Serum ADAM15 expression in asthmatic pa?tients and healthy controls

2.2 血清ADAM15 表達(dá)水平與外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、血清總IgE水平的相關(guān)性分析

分別以哮喘患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與百分比、血清總IgE水平為縱坐標(biāo)，血清ADAM15水平為橫坐標(biāo)，對所有樣本進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清ADAM15 水平與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比無明顯相關(guān)，而與總IgE水平呈顯著正相關(guān)（r=0.542 5，P=0.001 6），相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 哮喘組血清ADAM15表達(dá)水平與外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、百分比以及血清總IgE水平的相關(guān)性Figure 2 Correlation between serum ADAM15 expression and peripheral blood eosinophils count，percentage and serum total IgE in asthmatic patients

2.3 ADAM15在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)

小鼠肺組織免疫組化表明，ADAM15 在肺組織中主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，且哮喘小鼠支氣管上皮細(xì)胞ADAM15表達(dá)水平較對照小鼠升高（圖3）。

圖3 ADAM15在小鼠肺組織中的表達(dá)水平及分布Figure 3 The expression and distribution of ADAM15 in the mouse lung tissues

2.4 IL?13上調(diào)16HBE中ADAM15的轉(zhuǎn)錄水平

分別用10 ng/mL 的IL?4、IL?13、IL?17、TNF?α處理16HBE 細(xì)胞12 h 和24 h，PCR 結(jié)果表明，與不加任何細(xì)胞因子干預(yù)的對照組相比，其中IL?13 干預(yù)24 h 可顯著上調(diào)16HBE 內(nèi)ADAM15 mRNA 的表達(dá)水平（P＜0.01，圖4）。

圖4 細(xì)胞因子（10ng/mL）刺激12、24 h 對16HBE 細(xì)胞中ADAM15 mRNA水平的影響Figure 4 Effects of cytokines（10ng/mL）stimulation for 12 and 24 h on ADAM15 mRNA levels in 16HBE cells

2.5 IL?13上調(diào)16HBE中ADAM15的蛋白水平

用10 ng/mL 的重組IL?13 細(xì)胞因子處理16HBE細(xì)胞24 h，Western blot 結(jié)果表明，與不加干預(yù)的對照組相比，16HBE細(xì)胞內(nèi)ADAM15的蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 IL?13（10 ng/mL）刺激24 h對16HBE細(xì)胞中ADAM15蛋白水平的影響Figure 5 Effect of IL?13（10 ng/mL）stimulation for 24 h on ADAM15 protein expression in 16HBE cells

3 討論

本研究首次就ADAM15 在支氣管哮喘中可能作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ADAM15在哮喘患者血清中表達(dá)升高，與血清總IgE水平成正相關(guān)；哮喘小鼠模型中，ADAM15主要表達(dá)于肺組織支氣管上皮細(xì)胞，較對照組小鼠明顯增加；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL?13 可明顯上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞的ADAM15表達(dá)。以上結(jié)果提示ADAM15可能與IL?13 炎癥通路有關(guān)。

ADAM15屬于ADAM蛋白家族，分子量約90 kDa，是一種多結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白，其中金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域決定ADAM15具有水解膜結(jié)合分子的功能［5］。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM15與多種炎癥密切相關(guān)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［6］、動(dòng)脈粥樣硬化［7］患者的組織樣本中表達(dá)升高。本研究結(jié)果顯示，ADAM15 在哮喘患者血清也呈明顯增加，且與總IgE 水平成正相關(guān)，提示AD?AM15可能通過IgE介導(dǎo)的過敏機(jī)制，參與氣道炎癥的形成和發(fā)展。

ADAM15在多種組織中廣泛表達(dá)，有研究證實(shí)，慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmoriary disease，COPD）患者和COPD 小鼠模型中肺組織ADAM15明顯增多［8-9］。本研究通過哮喘小鼠模型，進(jìn)一步證實(shí)ADAM15主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，且哮喘小鼠表達(dá)較對照組明顯增多，提示哮喘患者ADAM15 主要來源于肺組織支氣管上皮。研究發(fā)現(xiàn)，IL?1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）?α等細(xì)胞因子可上調(diào)ADAM15 表達(dá)［6］，提示炎癥中細(xì)胞因子可能是調(diào)控ADAM15 表達(dá)的主要因素。本實(shí)驗(yàn)中，分別用Th2/Th1/Th17 炎癥因子刺激支氣管上皮細(xì)胞模擬哮喘氣道炎癥環(huán)境［10］，發(fā)現(xiàn)IL?13可明顯上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞ADAM15 表達(dá)。本課題組前期對IL?13刺激人原代支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IL?13刺激組ADAM15分泌水平較對照組升高3.47 倍（P=0.04），結(jié)合最近一項(xiàng)IL?13 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞ADAM15 表達(dá)的研究結(jié)果［11］，提示IL?13 可能是ADAM15 的重要調(diào)控因素。目前對于IL?13 上調(diào)ADAM15的機(jī)制尚不清楚，既往研究發(fā)現(xiàn)，ADAM15的啟動(dòng)子含有3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)［12］；在支氣管上皮細(xì)胞中，Sp1被發(fā)現(xiàn)也是IL?13的下游，IL?13激活Sp1后促進(jìn)Muc18蛋白表達(dá)［13］，因此，哮喘中，IL?13可能通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞ADAM15表達(dá)。

目前研究認(rèn)為，IL?13主要通過促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞活化募集和產(chǎn)生IgE，介導(dǎo)哮喘氣道炎癥［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADAM15 與外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)無明顯相關(guān)性，既往也有多項(xiàng)研究表明，哮喘患者血液嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)受晝夜節(jié)律、季節(jié)、治療方法等因素影響變異較大，不足以有效反映哮喘氣道炎癥情況［15-16］。而ADAM15與總IgE呈明顯正相關(guān)，提示ADAM15 可能參與IgE 的合成過程。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM15 可水解B 細(xì)胞膜上的IgE 受體CD23，使其脫落并釋放為sCD23［4］，sCD23脫落后仍與B細(xì)胞結(jié)合并促進(jìn)其合成IgE［17］。已有研究證實(shí)，哮喘患者血清sCD23 與總IgE 顯著相關(guān)［18］，而IL?13 使sCD23的分泌增多，提示哮喘中IL?13可能通過釋放sCD23促進(jìn)IgE合成［19］。結(jié)合本研究結(jié)果，IL?13促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞ADAM15 表達(dá)，由此我們推測，IL?13 通過上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞ADAM15，ADAM15 進(jìn)一步水解產(chǎn)生sCD23，使哮喘患者體內(nèi)IgE水平升高。鑒于IgE 是誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥級聯(lián)反應(yīng)，使炎癥持續(xù)存在的核心因素［20］，因此ADAM15可能作為抑制哮喘IgE上游合成過程的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究初步揭示ADAM15 在哮喘中的表達(dá)及潛在調(diào)控機(jī)制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)哮喘患者ADAM15與總IgE 明顯相關(guān)。明確ADAM15 在IgE 合成中的具體機(jī)制，以及ADAM15是否可能作為哮喘的潛在治療靶點(diǎn)，將成為我們下一步研究的目標(biāo)。