孫 瑩，王 萌，孫曉軍，王靖雷，馬 睿，余四九，潘陽陽*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730050）

牦牛（Bos grunniens）主要分布在海拔3 000～5 000 m的青藏高原地區(qū)，該地空氣稀薄、草料短缺。目前，牦牛為人類提供牦牛肉、牦牛奶、皮革制品，也可作為交通工具、使役工具，抗逆性極強(qiáng)，是牧民重要的生活來源、經(jīng)濟(jì)來源[1-3]。牦牛雖屬于季節(jié)性多次發(fā)情的動(dòng)物，但與生活在平原的其他家畜相比，70%的雌性個(gè)體在發(fā)情季節(jié)只發(fā)情一次，一頭成年牦牛平均繁殖率約48.61%，又因地處惡劣多變的高原環(huán)境，發(fā)情時(shí)間、生產(chǎn)性能極易受到季節(jié)性變化及牧草質(zhì)量的影響[4,5]。目前，對(duì)牦牛卵巢的研究多集中于解剖學(xué)范疇，而在分子機(jī)制上尚不完善[6]。因此，本研究以牦牛為模型，探究CYP19A1在不同發(fā)育時(shí)期卵泡及卵母細(xì)胞上的表達(dá)以及對(duì)牦牛生殖生理的調(diào)控。

卵巢是雌性哺乳動(dòng)物重要的生殖器官，具有促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)、排卵、黃體形成及溶解的功能，對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖力起決定性作用[7,8]。卵泡在卵巢中成熟的過程是受多種激素、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的復(fù)雜生物過程，其中以甾體激素為主要調(diào)節(jié)機(jī)制。CYP19A1是細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）家族的成員之一，在卵巢、胎盤、垂體等組織中均有不同程度的表達(dá)。由CYP19A1編碼的細(xì)胞色素P450芳香化酶是該通路的關(guān)鍵限速酶，卵泡膜細(xì)胞雄激素是E2的前體，它通過卵巢顆粒細(xì)胞的E2合成通路合成E2，即在粒細(xì)胞中催化雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に豙9]。其中，E2是雌激素中活性最高、妊娠期間母體最主要的雌激素。在分子水平上，E2促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡和卵泡閉鎖。研究表明，抑制CYP19A1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致E2分泌不足，卵泡閉鎖，無黃體生成[10,11]。因此，本研究檢測(cè)CYP19A1在牦牛不同級(jí)別卵泡及卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)水平及位置分布，旨在進(jìn)一步研究CYP19A1在牦牛雌性生殖中的作用機(jī)制，為探索牦牛特殊的生殖生理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phos-phate buffered saline，D-PBS）購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自PAN公司（澳大利亞）；TransZol RNA提取試劑盒（TransGen，北京）；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（艾科瑞生物，湖南）；SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒（寶生物，大連）；CYP19A1 Antibody（親科生物，常州）、免疫熒光檢測(cè)試劑購(gòu)于南京碧云天生物公司。

1.2 樣品采集與體外培養(yǎng)

2020年8—12月于青海省西寧市馬佳肴屠宰場(chǎng)采集牦牛卵巢，置于裝有35℃含抗生素（青鏈霉素）的生理鹽水中，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。37℃生理鹽水（含青鏈霉素）清洗3遍，用帶有18G針頭的注射器（防止針頭過細(xì)刮傷卵母細(xì)胞）抽取卵巢表面2～8 mm卵泡中的卵泡液，將提前在37℃恒溫箱內(nèi)平衡后的采卵液（D-PBS＋5%FBS）與卵泡液在離心管中混勻；將混合后的采卵液倒入50 mm培養(yǎng)皿中，置于體視顯微鏡下，用撿卵針挑選并移入裝有37℃采卵液的培養(yǎng)皿中，用無血清PBS清洗3次；然后轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別收集未成熟卵母細(xì)胞（0 h）、成熟12 h卵母細(xì)胞、成熟18 h卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞（24 h）各40枚，將不同階段卵母細(xì)胞分為兩份，一份用于提取RNA，-80℃保存，另一份置于固定液用于后續(xù)免疫熒光染色。

1.3 牦牛COCs及卵泡液總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

對(duì)于編碼基因的定量，首先需參照TransZol RNA提取試劑盒和Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ說明書，分別提取不同成熟階段COCs的RNA（0 h、12 h、18 h和24 h）和卵泡大小為0～3 mm、3～5 mm、5～8 mm及大于8 mm時(shí)卵泡液的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)cDNA，存于-20℃，用于后續(xù)qRT-PCR檢測(cè)。

1.4 設(shè)計(jì)引物

根據(jù)Genbank上所公布的牛的CYP19A1、β-Actin基因的基因序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成所需引物，其詳細(xì)信息及反應(yīng)條件見表1，利用普通PCR對(duì)引物進(jìn)行初步驗(yàn)證。

表1 CYP19A1引物信息

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CYP19A1基因的相對(duì)表達(dá)量

使用LightCycler? 96 SW 1.1（Roch，Switzerland）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，總體系20 μl，反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μl（500 ng/μl），上、下游引物各0.5 μl（0.2 μmol/ml），2*SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μl，ddH2O 8 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 s；95℃變性10 s、退火10 s（具體溫度見表1）、72℃延伸10 s，重復(fù)共40個(gè)循環(huán)，建立4個(gè)重復(fù)，設(shè)置β-Actin為內(nèi)參基因，根據(jù)熔解曲線確定反應(yīng)特異性，利用所得每個(gè)樣品的循環(huán)閾值（Ct值），采用2-ΔΔCt法計(jì)算CYP19A1的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)COCs中CYP19A1蛋白的表達(dá)

通過免疫熒光染色技術(shù)對(duì)卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體的CYP19A1蛋白進(jìn)行定位檢測(cè)，首先對(duì)在4℃用交聯(lián)劑（4%多聚甲醛）固定后的細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證后續(xù)抗體能夠順利進(jìn)入相應(yīng)抗原位點(diǎn)，其次使用免疫封閉液孵育1 h，使非特異性結(jié)合蛋白位點(diǎn)封閉，再用CYP19A1抗體4℃孵育過夜，清洗3遍后用二抗孵育結(jié)合，再清洗3遍用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色，最后清洗3遍封片鏡驗(yàn)，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（oneway，ANOVA），每組至少重復(fù)3遍以上，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，通過Graphpad prism 7繪制柱狀圖（P<0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP19A1引物特異性檢測(cè)

2.1.1 核酸電泳檢測(cè)引物特異性 對(duì)卵泡液、COCs的RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，CYP19A1、β-Actin PCR產(chǎn)物大小分別為184 bp、143 bp，核酸電泳結(jié)果如圖1所示，可見片段大小與預(yù)期一致，條帶成像清晰，無非特異性結(jié)合片段。由此可見，所設(shè)計(jì)的引物特異性良好、模板質(zhì)量高。需特別注意CYP19A1基因在卵泡大小為3～5 mm及大于8 mm的卵泡液中不表達(dá)，具體結(jié)果可結(jié)合后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行分析。

圖1 CYP19A1在卵泡液和卵母細(xì)胞中表達(dá)的核酸電泳結(jié)果

2.1.2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CYP19A1擴(kuò)增所得熔解曲線的結(jié)果 通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CYP19A1的擴(kuò)增情況，驗(yàn)證其引物特異性，結(jié)果如圖2所示。熔解曲線是單峰，且出峰位置即退火溫度，再次證明該引物特異性良好。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)CYP19A1擴(kuò)增所得熔解曲線的結(jié)果

2.2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CYP19A1在不同階段卵泡液和COCs中的表達(dá)結(jié)果

qRT-PCR結(jié)果如圖3所示，CYP19A1在卵泡液發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量隨卵泡增大呈逐漸下降趨勢(shì)。在卵泡大小為0～3 mm時(shí)，CYP19A1的相對(duì)表達(dá)量最高，卵泡大小大于5 mm的卵泡液中CYP19A1表達(dá)量已呈現(xiàn)較低水平。同樣在COCs成熟的各個(gè)階段均表達(dá)，在未成熟的COCs中，CYP19A1的相對(duì)表達(dá)量最低，成熟18 h的COCs中相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值，之后呈下降趨勢(shì)。

2.3 免疫熒光染色檢測(cè)CYP19A1蛋白在COCs上的表達(dá)定位

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的COCs進(jìn)行免疫熒光染色處理后，結(jié)果如圖4所示，CYP19A1在不同時(shí)期COCs的卵丘細(xì)胞、卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，并且目的蛋白表達(dá)位置與骨架蛋白β-Tubulin表達(dá)位置一致。同時(shí)，由圖4可見在成熟18 h的COCs卵丘細(xì)胞中CYP19A1蛋白的熒光信號(hào)更明顯，對(duì)比DAPI細(xì)胞核標(biāo)記，CYP19A1主要在卵丘細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

3 討論

由垂體釋放的催乳素（Prolactin，PRL）、促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）共同作用，能顯著促進(jìn)促性腺激素釋放激素（Gonadotrophin releasing hormone，GnRH）誘導(dǎo)的睪酮（Testosterone，T）和雌二醇的釋放[12,13]。誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞釋放類固醇激素，調(diào)控卵泡和顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以及相關(guān)基因（FSHR、LHR、CYP11、CYP19）的表達(dá)，其中基因CYP19A1的表達(dá)活化芳香化酶，催化雄激素芳香化，將睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，誘導(dǎo)卵泡正常發(fā)育、優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇、維持卵巢正常的組織結(jié)構(gòu)[14-16]。由此可見，卵泡和顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育均依賴于E2的分泌，CYP19A1在其中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，是母畜提高繁殖力的重要保障[17]。另有研究表明，敲除小鼠CYP19A1基因，E2分泌量下降，卵泡由此發(fā)生閉鎖，卵巢無黃體產(chǎn)生，雌性動(dòng)物性狀發(fā)育偏雄性化，甚至引起小鼠不孕[18-20]。由此可見，CYP19A1對(duì)雌性哺乳動(dòng)物的發(fā)育繁殖產(chǎn)生積極影響，特別是對(duì)卵泡的擴(kuò)張、卵母細(xì)胞的成熟發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本研究以牦牛不同發(fā)育時(shí)期的卵泡和不同成熟階段的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體為模型，對(duì)提高牦牛生產(chǎn)性能具有重要的實(shí)踐意義。

通過利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的卵泡及卵母細(xì)胞中CYP19A1基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CYP19A1基因在卵泡大小為0～3 mm時(shí)的表達(dá)量最高，隨著卵泡大小的擴(kuò)增、卵泡的成熟，表達(dá)量逐漸降低，而在COCs發(fā)育早期表達(dá)量相對(duì)較低，COCs成熟18 h時(shí)表達(dá)量最高。由此可見，CYP19A1在卵泡發(fā)育早期主要集中于卵母細(xì)胞，在卵子形成過程中發(fā)揮重要作用，促使卵泡擴(kuò)張，而在卵泡細(xì)胞發(fā)育后期，CYP19A1的表達(dá)則集中于卵丘細(xì)胞上，通過誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞釋放E2，加速卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)交換、物質(zhì)代謝，以卵母細(xì)胞為靶細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。根據(jù)免疫熒光染色結(jié)果與上述結(jié)果對(duì)應(yīng)，CYP19A1在COCs的卵丘細(xì)胞中熒光強(qiáng)度更高，推測(cè)CYP19A1在COCs中主要在卵丘細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)激素分泌，作用于卵母細(xì)胞，增強(qiáng)卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞間的物質(zhì)代謝，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在牦牛不同級(jí)別卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的過程中對(duì)CYP19A1的表達(dá)進(jìn)行定位分析，研究發(fā)現(xiàn)CYP19A1基因在牦牛不同級(jí)別的卵泡及卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，其中分別在卵泡發(fā)育早期（0～3 mm）、成熟18 h的COCs中表達(dá)量最高，免疫熒光染色結(jié)果顯示CYP19A1在COCs中的表達(dá)主要集中在卵丘細(xì)胞，推測(cè)CYP19A1參與并促進(jìn)卵泡的發(fā)生和卵母細(xì)胞的形成，揭示了CYP19A1在雌性牦牛的生殖過程中對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟均起到積極的調(diào)控作用，為進(jìn)一步探索牦牛生殖生理中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。