張開琴，王 剛，窮 珍，巴 桑，次旺羅杰，石 次，索朗斯珠

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 林芝 860000）

牦牛是高寒地區(qū)的特有牛種，草食性反芻家畜，常見于西藏、青海等高寒高海拔地區(qū)，以前被農(nóng)牧民作為勞役勞動(dòng)力使用，其飼養(yǎng)模式多為放牧散養(yǎng)和部分半舍式飼養(yǎng)[1]。牦牛大腸桿菌病是由大腸桿菌感染牦牛引起的一種以腹瀉、敗血癥為主要特征的急性傳染病，在西藏牧區(qū)流行較為普遍，不僅影響牦牛健康，還制約牦牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。大腸桿菌在牦牛體內(nèi)屬于常在菌，可通過致病性大腸桿菌感染導(dǎo)致牦牛腹瀉，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)發(fā)生死亡，目前主要依靠抗生素進(jìn)行大腸桿菌病的預(yù)防和治療，易產(chǎn)生耐藥性[3]。大腸桿菌病的耐藥性問題已日趨嚴(yán)重，也從未停止過對(duì)其耐藥性的監(jiān)測(cè)[4-7]。大量試驗(yàn)證實(shí)大腸桿菌可經(jīng)接合、轉(zhuǎn)座等方式進(jìn)行水平傳播[8]，臨床可通過檢測(cè)耐藥基因的存在情況，對(duì)耐藥流行情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本試驗(yàn)以拉薩市林周縣牦牛腹瀉糞便為靶標(biāo)，通過常規(guī)的細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行腹瀉病原菌的分離鑒定，然后使用國(guó)際公認(rèn)的K-B紙片法對(duì)常用抗生素的藥物敏感性情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)[9]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品來源

本試驗(yàn)的40份牦牛腹瀉糞便均采集于拉薩市林周縣某牛場(chǎng)。

1.2 質(zhì)控菌株來源

質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要試劑

氯霉素、青霉素、多粘菌素B等15種抗菌藥物均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，沙門菌分離鑒定所用培養(yǎng)基干粉均購(gòu)自美國(guó)BD公司，PCR試劑、核酸染料4S Red plus等購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.4 主要儀器

高速離心機(jī)centrifuge 5804，由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增設(shè)備，由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；移液器，由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；核酸蛋白測(cè)定儀，由Thermo公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 生化試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)生化試驗(yàn)，并按照說明書判定反應(yīng)結(jié)果。

2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)按照CLSI推薦的K-B法進(jìn)行。抑菌結(jié)果可依據(jù)表1所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[10，11]。

2.3 引物設(shè)計(jì)

從GenBank中檢索已登錄的信息，用DNA Star軟件找出保守序列，然后采用Primer 5設(shè)計(jì)16S rRNA序列P基因引物（F:5′-ATGGCTCAGA TTGAACGC-3′；R：5′-CAGGTTCCCCTAC GGTTA-3′，Product：1 500 bp），沙門菌腸毒素Stn基因引物（F:5′-CTTTGGTCGTAAAATA AGGCG-3′；R：5′-TGCCCAAAGCAGAGA GATTC-3′，Product：260 bp）[12,13]，引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.4 PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系及條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀讀數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 腹瀉病原菌的分離鑒定

3.1.1 培養(yǎng)特性 根據(jù)分離菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性，結(jié)合染色鏡檢最終鑒定出40株革蘭氏陰性分離菌株均符合大腸桿菌特性；XLT4平板上未見黑色中心，周圍有透明暈環(huán)菌落，再經(jīng)過Stn基因的分離檢測(cè)也未見目的條帶，可見糞檢病原菌中無沙門菌存在。

3.1.2 生化特性 生化特性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離菌株基本符合大腸桿菌的生化培養(yǎng)特征，再結(jié)合其培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，將造成此次牦牛腹瀉的病因歸結(jié)于大腸桿菌病。

3.1.3 16S rRNA序列P基因的擴(kuò)增 由圖1可知，擴(kuò)增所得片段大小約為1.5 kb，條帶單一，無明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。部分菌株的P基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1，在1 500 bp左右有特異性條帶，與目的條帶大小一致。

表1 12種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

圖1 部分菌株的P基因電泳

3.2 藥敏試驗(yàn)

40株西藏牦牛源大腸桿菌對(duì)12種常見藥物均存在不同程度的耐藥性，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 40株大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 西藏牦牛源腹瀉病原菌分離鑒定結(jié)果

通過細(xì)菌分離鑒定，共獲得40株西藏牦牛源大腸桿菌，確定導(dǎo)致此次牦牛腹瀉的主要原因是大腸桿菌病。

4.2 西藏牦牛源腹瀉病原菌耐藥性流行特點(diǎn)

藥物敏感性結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所分離的腹瀉病原菌對(duì)青霉素、磺胺類藥物的耐藥率分別為60%、82.5%，由此可見西藏牦牛源大腸桿菌對(duì)常用抗生素存在一定的耐藥性，尤其對(duì)磺胺類藥物耐藥性最嚴(yán)重。結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議該牛場(chǎng)可優(yōu)選氨基糖胺類和喹諾酮類藥物進(jìn)行治療。

4.3 合理用藥，減少耐藥現(xiàn)象

細(xì)菌耐藥性問題已成為國(guó)際難題，本研究也發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)常用抗生素存在一定的耐藥性。因此，臨床用藥時(shí)要注意合理使用抗生素，并對(duì)耐藥流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)以防耐藥性的產(chǎn)生[15]。