陸 萍，倪東杰，鄭 巍，郭良君，王 翔 （陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院，浙江 湖州 313000）

養(yǎng)血安神糖漿為陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱本院）自制制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：南制字（2016）B504019），由首烏藤、雞血藤、熟地黃、合歡皮、墨旱蓮、仙鶴草和生地制成，具有滋陰養(yǎng)血、寧心安神功效，臨床用于精神倦怠、失眠健忘、腎虛腰酸、頭暈乏力。首烏藤為方中君藥，為蓼科植物何首烏的干燥根莖，具養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，主含2,3,5,4’-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷[1]。處方中墨旱蓮、仙鶴草、合歡皮中均含槲皮苷；墨旱蓮、仙鶴草、熟地黃、生地中均含木犀草苷；墨旱蓮、仙鶴草中均含蘆丁[2-4]。槲皮苷、木犀草苷和蘆丁均屬于黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能[5-6]。因此，將槲皮苷、木犀草苷和蘆丁作為黃酮類成分的指標(biāo)性成分進(jìn)行整體質(zhì)量控制。養(yǎng)血安神糖漿現(xiàn)行《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》[7]標(biāo)準(zhǔn)只有檢查項(xiàng)，未收載含量測(cè)定方法，不利于質(zhì)量控制。因此，筆者以安神作用突出的槲皮苷和葡萄糖苷，以及木犀草苷和蘆丁為測(cè)定指標(biāo)，建立同時(shí)測(cè)定4 組分含量的HPLC 法，填補(bǔ)了制劑無含量測(cè)定方法的空白，并為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及工藝改進(jìn)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters 2 489 雙波紫外可見光檢測(cè)器，Empower 3 工作站[沃特世科技（上海）有限公司]；756PC 紫外可見光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KQ2200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（上海精若科學(xué)儀器有限公司）；Sartorius BS 124S 型電子天平（德國(guó)賽多利斯）；80-2 臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠）。

1.2 試藥

2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：110844-201109）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111538-201606）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111801-201003）和蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用。養(yǎng)血安神糖漿（本院制劑室自制，規(guī)格：250 ml/瓶，批號(hào)：191008、 191211、 200309、 200422、 200519） ；100%甲醇為色譜純（德國(guó)默克股份兩合公司），分析純95%乙醇，水為重蒸去離子水，其他試劑均為分析純。

2 含量測(cè)定

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

①對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取槲皮苷、木犀草苷、蘆丁對(duì)照品各10.0 mg，2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品20.0 mg，分別置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成槲皮苷、木犀草苷、蘆丁1 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷2 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。②對(duì)照品稀釋液：分別精密量取槲皮苷、木犀草苷、蘆丁、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 ml，加甲醇稀釋至10 ml，制成含槲皮苷、木犀草苷、蘆丁對(duì)照品稀釋液各0.2 mg/ml，2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品稀釋液0.4 mg/ml。③混合對(duì)照溶液：分別精密量取4 組分對(duì)照品稀釋液各1 ml置5 ml 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.2 供試品溶液

精密量取養(yǎng)血安神糖漿10 ml，加甲醇稀釋至50 ml，超聲（100 W，40 kHz）15 min，離心10 min(轉(zhuǎn)速：4 000 r/min，離心半徑12 cm)，取上清液微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得[8]。

2.2 色譜條件[9-10]

色譜柱為Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相：0.1%醋酸（A）-甲醇（B），按如下條件梯度洗脫：0～15 min，95%～90%A；15～35 min， 90%～70%A； 35～55 min， 70%～60%A； 55～85 min， 60%～50%A； 85～95 min，10%A。每一針結(jié)束后以初始比例平衡20 min；流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁為320 nm，槲皮苷和木犀草苷均為256 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。在上述條件下，蘆丁、槲皮苷、木犀草苷和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)均不低于3 000，見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 養(yǎng)血安神糖漿供試品和對(duì)照品的HPLC 圖

精密吸取槲皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.6、1.5、3.0 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成20、60、150、300 μg/ml 對(duì)照品溶液。再對(duì)上述20 μg/ml 對(duì)照品溶液進(jìn)行對(duì)半稀釋，獲得10 μg/ml對(duì)照品溶液。最終獲得10～300 μg/ml 濃度梯度的槲皮苷對(duì)照品溶液。分別精密吸取木犀草苷和蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.5 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成10、50、150 μg/ml對(duì)照品溶液，再依次對(duì)上述對(duì)照品溶液進(jìn)行對(duì)半稀釋，獲得5、25、75 μg/ml 對(duì)照品溶液。最終分別獲得5～150 μg/ml 濃度梯度的木犀草苷和蘆丁對(duì)照品溶液。精密吸取2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、1.5、3.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成40、300、600 μg/ml 對(duì)照品溶液。再對(duì)上述對(duì)照品溶液進(jìn)行對(duì)半稀釋，獲得20、150、300 μg/ml 對(duì)照品溶液。最終獲得20～600 μg/ml 濃度梯度的2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μl，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)直線回歸得線性方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，4 組分在一定濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，該法滿足定量檢測(cè)要求。

表1 4 組分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液2 ml，加甲醇稀釋至10 ml，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次，記錄峰面積。結(jié)果表明，4 種組分峰面積RSD＜3%（n=5），表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號(hào)：200 309）樣品6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定4 種組分含量，結(jié)果槲皮苷、木犀草苷、蘆丁和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量值分別為：106.34、43.66、24.68 和427.12 μg/ml，4 種組分含量RSD 分別1.2%，1.5%，1.6%，1.7%（n=6），表明重現(xiàn)性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：200309），每隔4 h按“2.2”項(xiàng)下方法，分別于0、4、8、12、16、20、24 h測(cè)定4 種組分的峰面積值。結(jié)果槲皮苷、木犀草苷、蘆丁和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面積分別為196142、96161、37893、1923385，RSD 分別為0.8%，0.9%，1.2%，1.0%（n=7），供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的養(yǎng)血安神糖漿（批號(hào)：200309，槲皮苷、木犀草苷、蘆丁和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量為：106.34、43.66、24.68 和427.12 μg/ml)1 ml，平行量取6 份，分別精密加入“2.1.1”項(xiàng)下槲皮苷、木犀草苷、蘆丁和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品稀釋液液各0.5、0.2、0.1、1.0 ml，按“-2.1.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣前用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，每組測(cè)6 次，結(jié)果平均加樣回收率分別為（96.75±1.41）%、（99.61±1.01）%、（97.18±1.96）%、（99.12±0.97）%，n= 6，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 樣品含量測(cè)定

按上述方法測(cè)定4 批養(yǎng)血安神糖漿含量，每批平行測(cè)定3 次，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的4 組分極性差異較大，選擇流動(dòng)相時(shí)，先后考察0.1%醋酸-甲醇、0.1%醋酸-乙腈、0.1%磷酸鹽-甲醇和0.1%磷酸鹽-乙腈溶液系統(tǒng)梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.1%醋酸-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，體系的基線平穩(wěn)，峰型及分離度均顯著優(yōu)于其他體系，4 組分色譜峰分離完全。

3.2 蘆丁檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)槲皮苷、木犀草苷、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在雙波長(zhǎng)256 nm、320 nm下測(cè)得的色譜峰顯示，分離度、色譜峰正態(tài)分布及峰面積都具有一致性，因此，根據(jù)色譜峰特征選擇波長(zhǎng)毫無爭(zhēng)議。但是，在256 nm 波長(zhǎng)下，蘆丁測(cè)得的峰面積是320 nm 波長(zhǎng)下峰面積的2 倍，而320 nm波長(zhǎng)下的峰分離度為3.4，256 nm 波長(zhǎng)下的峰分離度為1.8。從供試品圖譜觀察，在320 nm 下峰形對(duì)稱性較好。綜上因素考量，本實(shí)驗(yàn)將蘆丁的檢測(cè)波長(zhǎng)定為320 nm。

3.3 提取條件優(yōu)化[11]

同時(shí)考察了以50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇、95%乙醇超聲提取供試品，綜合比較各組分的含量，最終選擇100%甲醇超聲提取的方法處理供試品。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了以高效液相雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定槲皮苷、木犀草苷、蘆丁和2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷4 組分含量的方法，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于養(yǎng)血安神糖漿的質(zhì)量控制，亦為下一步對(duì)養(yǎng)血安神糖漿的工藝改進(jìn)研究打下了基礎(chǔ)。

表2 養(yǎng)血安神糖漿含量測(cè)定結(jié)果(μg/ml，n=3， ±s)

表2 養(yǎng)血安神糖漿含量測(cè)定結(jié)果(μg/ml，n=3， ±s)

批號(hào) 槲皮苷 RSD（%） 木犀草苷 RSD（%） 蘆丁 RSD（%） 2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 RSD（%）191 008 96.90 1.71 43.19 2.29 23.19 2.73 430.01 1.12 94.67 44.07 22.98 422.76 97.88 45.21 24.18 421.03 191 211 107.13 2.84 40.86 1.44 23.52 2.77 427.65 0.69 102.34 41.34 22.26 422.11 101.76 42.05 23.57 423.16 200 422 104.16 2.29 41.93 2.66 24.53 2.06 425.06 0.96 99.82 40.18 23.84 428.17 100.55 42.22 23.57 433.26 200 519 101.33 1.36 40.54 1.92 20.19 2.54 422.18 0.79 98.64 41.62 21.91 425.86 99.71 42.10 20.85 419.13