雷瑩 陳毅

心腦血管疾病已成為威脅人類健康的第一殺手。據(jù)我國衛(wèi)計委2013 年大城市居民死亡原因統(tǒng)計,心臟病排在第二位。隨著人們生活水平的提高以及生活方式的改變,我國心血管疾病的發(fā)生率還會有上升趨勢。急性心肌梗死發(fā)生時血液供應(yīng)阻斷30 min 以上即可導致心肌細胞不可逆的損傷甚至死亡,及時恢復血供被視為挽救部分心肌細胞功能的重要措施［1,2］。然而,心肌得到血液再灌注后,不僅功能未得到恢復,反而使心肌損傷加重,出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴大等病變［3,4］。心梗后損傷局部會形成缺血缺氧微環(huán)境,炎癥介質(zhì)滲出浸潤,還有再灌注損傷等等,都不利于心肌細胞在損傷區(qū)域的存活,如果能提高心肌細胞的存活能力,將可能明顯提高介入治療開通臨床心肌梗死血管后細胞存活率,從而達到更加的治療效果。PTEN 基因最先是作為抑癌基因被發(fā)現(xiàn)的,研究證實PTEN 基因能有效抑制腫瘤細胞的生長并具有特異性磷酸酶活性。新近研究還發(fā)現(xiàn)PTEN 基因還有促進細胞凋亡作用,其作用機制是通過抑制蛋白激酶B(Akt)途徑而使Bcl-2 蛋白表達增加。因此本研究設(shè)計通過RNA 干擾抑制體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞的PTEN 基因,從而促進心肌細胞的生長能力和抗凋亡能力,提升心肌細胞對心肌梗死區(qū)域缺血缺氧微環(huán)境的耐受能力,對抗炎癥介質(zhì)滲出和再灌注損傷,從而為臨床心肌梗死區(qū)域的心肌細胞存活提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料 SD 大鼠［許可證號:scxk(滬)2016-0001］,兔抗鼠ɑ-Sarcomeric Actin一抗,PTEN引物(TAKARA),PTEN 基因的特異siRNA(Qiagen 公司設(shè)計合成),改良蒂羅德溶液［各種成分含量：氯化鈉(NaCl)：136.9 mmol/L,氯化鉀(KCl)：2.68 mmol/L,十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12 H2O)：8.1 mmol/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4)：1.47 mmol/L,氯化鈣(CaCl2)：0.9 mmol/L,六水氯化鎂(MgCl2·6 H2O)：0.49 mmol/L］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌體外分離、純化和擴增培養(yǎng) 取出生1～3 d 的SD 大鼠8 只,乙醚吸入麻醉后,消毒,取出心臟,用4℃無菌的 D-Hanks 緩沖液清洗干凈,在預冷的無菌培養(yǎng)皿中將心臟剪成約1 mm 大小組織塊(全程在冰盒上操作)。通過消化、離心、重懸細胞、過濾、貼壁培養(yǎng)2 h,收集未貼壁的細胞懸液,接種于培養(yǎng)皿,接種后48 h 首次換液,培養(yǎng)5 d。獲得貼壁生長的原代心肌細胞。再通過傳代,獲得足夠數(shù)量的心肌細胞。

1.2.2 對獲得的心肌細胞進行鑒定 對心肌細胞胞漿內(nèi)ɑ-橫紋肌肌動蛋白免疫熒光染色,對心肌細胞進行鑒定。

1.2.3 實驗分組 將獲得的心肌細胞根據(jù)實驗要求分為：對照組：為空白對照組,未進行脂質(zhì)體法(Lipofectamin2000)轉(zhuǎn)染,其他培養(yǎng)條件一樣；陰性對照組：用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染同一公司設(shè)計的無意義的siRNA；PTEN 干擾組：用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Qiagen 公司設(shè)計合成PTEN 基因特異的siRNA。

1.2.4 PTEN 基因沉默 Qiagen 公司設(shè)計合成針對PTEN 基因的特異siRNA,合成3 條,通過公司檢測,選取其中1 條沉默效率達到90%以上的特異siRNA 用于實驗,并檢測證明沉默有效時間為4～10 d。同時公司設(shè)計合成提供的無意義的siRNA,用于陰性對照,其序列見表1。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染于心肌細胞,并檢測 PTEN mRNA 的表達變化情況。

表1 Qiagen 公司設(shè)計合成siRNA 序列

1.2.5 RT-PCR 法檢測PTEN mRNA 提取各實驗組的心肌細胞總RNA,按RT-PCR 試劑盒操作說明操作、擴增、電泳、顯色、掃膠。檢測干擾前后PTEN mRNA表達的變化情況。［注：PTEN 基因的引物序列：上游為5'-CCAATGGCTAAGTGAAGACGACAA-3',下游為5'-CATAGCGCCTCTGACTGGGAATA-3',內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)］

1.2.6 模型制備和條件培養(yǎng) 各組細胞培養(yǎng)液更換為改良蒂羅德溶液。置入三氣缺氧培養(yǎng)箱,連續(xù)充以90%氮氣(N2),9%二氧化碳(CO2)和1%氧氣(O2)混合的三種氣體,培養(yǎng)4 h 后取出,更換成常規(guī)培養(yǎng)液,在正常培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2 h 取出各組細胞,制備成細胞培養(yǎng)氧糖剝奪/復氧模型。

1.2.7 對條件培養(yǎng)后的各組細胞進行細胞凋亡檢 測 取氧糖剝奪/復氧模型條件培養(yǎng)后的各組細胞各 1 瓶,消化,離心,收集細胞,重懸計數(shù)。使用Annexin V 凋亡試劑盒對各組細胞進行操作,上流式細胞儀,檢測各組細胞凋亡數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)的大鼠心肌細胞形態(tài) 貼壁生長的心肌細胞呈梭形、多邊形或不規(guī)則形態(tài),偶爾可見心肌細胞搏動,細胞生長擴增后可互相連接交織成網(wǎng)狀,形成單層心肌細胞或細胞簇。見圖1。

圖1 大鼠心肌細胞

2.2 大鼠心肌細胞鑒定 大鼠心肌細胞鑒定：對心肌細胞胞漿內(nèi)ɑ-橫紋肌肌動蛋白免疫熒光染色,對心肌細胞進行鑒定。通過熒光顯微鏡下可見心肌細胞胞漿內(nèi)綠色熒光,認為大鼠心肌細胞胞漿內(nèi)ɑ-橫紋肌肌動蛋白高表達。見圖2。

圖2 免疫熒光染色

2.3 PTEN 基因的表達情況檢測結(jié)果 使用RT-PCR法對各實驗組細胞PTEN mRNA 進行檢測,檢測結(jié)果示RNA 干擾組中PTEN mRNA 表達明顯減弱,提示通過PTEN 基因的特異siRNA 對心肌細胞轉(zhuǎn)染后能有效沉默心肌細胞的PTEN 基因,對照組和陰性對照組PTEN基因表達無明顯變化。見圖3。

圖3 RT-PCR 結(jié)果

2.4 細胞凋亡檢測 使用流式細胞儀對條件培養(yǎng)后的各組細胞進行細胞凋亡檢測,結(jié)果顯示：氧糖剝奪/復氧模型條件培養(yǎng)后的各組細胞均可見明顯凋亡,RNA干擾組凋亡細胞計數(shù)要明顯少于對照組和陰性對照組,提示PTEN 基因特異的siRNA 對心肌細胞的PTEN 基因有效的沉默能抑制細胞凋亡。見圖4。

圖4 氧糖剝奪/復氧模型條件培養(yǎng)前、后各組細胞凋亡情況檢測

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病是危害人類健康的主要疾患之一,其發(fā)病率高,危害性大,預后差一直困擾者世界各國的研究人員和醫(yī)務(wù)人員。急性心肌梗死發(fā)生時血液供應(yīng)阻斷可導致心肌細胞缺血缺氧,能量供應(yīng)中斷,炎癥介質(zhì)浸潤,出現(xiàn)心肌細胞凋亡、壞死,瘢痕組織形成,心肌收縮能力下降,導致心功能下降,嚴重者危及生 命［5］。細胞凋亡現(xiàn)象是一種主動的細胞消亡過程。往往是由細胞接受某種信號或受到某些因素刺激下產(chǎn)生的。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死后梗死區(qū)也存在細胞凋亡現(xiàn)象,并且發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)細胞凋亡率更高于非梗死 區(qū),并認為心肌缺血是心肌細胞凋亡強有力的誘導因素［6］。近年研究主要集中在抑制心肌細胞凋亡來恢復心功能方面,并提出特異性和非特異性的抗凋亡治療在預防和治療心肌梗死后的心肌重塑和心力衰竭中發(fā)揮重要的作用［7］。Zhao 等［8］認為,缺血誘發(fā)的心肌細胞凋亡在左室收縮功能降低方面起到了重要的作用,抑制心肌細胞凋亡可減輕心肌缺血損害、改進心功能。

PTEN 基因是1997 年克隆出的第一個具有特異性磷酸酶活性新型腫瘤抑制基因,能有效抑制腫瘤細胞的生長。該基因具有廣泛的同源性。PTEN 基因具有促進細胞凋亡作用,其沉默能促進細胞增殖和更新,研究發(fā)現(xiàn)PTEN 基因能通過抑制細胞周期相關(guān)基因來調(diào)節(jié)細胞周期的進展,相關(guān)研究通過基因敲除法敲除p53和PTEN 雙重基因,導致Myc 基因高表達,從而抑制分化,維持持續(xù)的細胞更新［9-11］。同時,PTEN 基因還有促進細胞凋亡作用,通過沉默PTEN 基因可抑制細胞凋亡,提升細胞抗凋亡能力,但其機制尚未明確［12］。因此,本項目選擇對心肌細胞的PTEN 基因進行修飾。發(fā)現(xiàn)PTEN 基因沉默后的細胞對氧糖剝奪/復氧模型有較強的耐受能力。

RNA 干擾是一種由雙鏈RNA 介導的序列特異性基因沉默現(xiàn)象［13］。其特點包括特異性高,效果明確,同時具有時效性。所以本研究選擇通過脂質(zhì)體法對體外培養(yǎng)的心肌細胞繼續(xù)PTEN 基因特異的siRNA 轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染成功后檢測其沉默效率,發(fā)現(xiàn)沉默效果可達90%以上,但siRNA 在細胞能不穩(wěn)定,逐漸被細胞降解排除體外,細胞恢復正常,因此RNA 干擾是一種有效的、短暫性的基因沉默手段。這是本實驗設(shè)計的關(guān)鍵,PTEN 基因作為抑癌基因,其長期沉默具有致瘤性,基因敲除法不可取,所以本實驗通過siRNA 的短期沉默即達到心肌細胞移植時抑制細胞凋亡的作用,同時又避免了腫瘤形成。

綜上所述,PTEN 基因特異的siRNA 對心肌細胞的PTEN 基因有效的沉默能抑制大鼠心肌在耐受氧糖剝奪/復氧的環(huán)境中細胞凋亡,增強了細胞的存活能 力,為臨床心肌梗死區(qū)域的心肌細胞存活提供新的治療思路。