劉春平 熊德芳 譚耀駒

耐多藥結(jié)核是指結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼兩種主要抗結(jié)核藥物同時產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病。我國是耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，耐多藥結(jié)核病是目前控制結(jié)核病的主要難題和重要挑戰(zhàn)。目前表型藥敏試驗是確診耐多藥結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時長、操作復(fù)雜，遠(yuǎn)不能滿足臨床診治的的需求，因此，迫切需要建立快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核桿菌耐藥性的方法。分子生物學(xué)技術(shù)可將結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的診斷從幾周減少到幾個小時[1]，而逐漸成為該領(lǐng)域的發(fā)展方向。雖然2011年Xpert MTB/RIF分子技術(shù)被WHO推薦用于結(jié)核的快速診斷和利福平耐藥性檢測，但該方法成本高且不能檢測異煙肼耐藥突變。目前國內(nèi)很多地區(qū)已經(jīng)開展的熒光PCR熔解曲線法和線性探針方法，可一次同時檢測多個基因突變位點(diǎn)，但鮮見對這兩種分子方法結(jié)核耐藥性效果比較的相關(guān)報道。本研究采用熒光PCR探針熔解曲線方法及線性探針技術(shù)，檢測一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼耐藥性，以表型藥敏試驗方法為參考，分析這兩種分子方法檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能。

資料與方法

一、材料收集

回顧性分析2013年12月-2014年3月廣州市胸科醫(yī)院186例涂陽肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本檢測結(jié)果。每例患者的同一份痰標(biāo)本行痰涂片鏡檢、BACTAC MGIT 960液體培養(yǎng)以及熒光PCR熔解曲線法和線性探針法對結(jié)核分枝桿菌耐藥基因進(jìn)行檢測，對培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行表型藥敏試驗。涂陽性患者的186例痰標(biāo)本分離培養(yǎng)，7例污染，10例培養(yǎng)陰性，169例為陽性培養(yǎng)菌株，經(jīng)菌種鑒定13例為非結(jié)核分枝桿菌，最終獲得156例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。156例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，4例熒光PCR熔解曲線檢測Ct值與陰性對照重疊，判定為無效，11例線性探針檢測質(zhì)控TUB條帶缺失，判為未檢測到結(jié)核分枝桿菌，142例同時獲得表型藥敏試驗、熒光PCR熔解曲線及線性探針法檢測結(jié)果。最終用于評估熒光PCR熔解曲線和線性探針方法對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測效能的142例患者中，男性103例，女性39例，平均年齡 48.37±17.32歲。

二、方法

1 標(biāo)本收集和培養(yǎng)

經(jīng)抗酸染色證實為陽性的痰標(biāo)本，加入2～3倍體積的4% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)，液化15min。將液化后的痰標(biāo)本分成三份，一份用于熒光PCR熔解曲線法DNA提取、一份用于線性探針法DNA提取、一份用于分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》使用BACTEC MGIT960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行[2]。

2 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和藥敏試驗

對分離培養(yǎng)出的陽性產(chǎn)物按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》實驗操作方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和利福平和異煙肼藥敏試驗[2]。

3 熒光PCR探針熔解曲線法檢測利福平及異煙肼耐藥性

取1mL液化后的痰標(biāo)本，12000g離心10min，棄上清。重懸于250μl TB DNA提取液中，渦旋振蕩混勻。封口膜封口，99℃加熱10min，12000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至半自動核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)進(jìn)行核酸提取，提取液作為DNA模板，4℃或-20℃保存。

采用熒光PCR探針熔解曲線法(結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒、異煙肼耐藥突變檢測試劑盒均為廈門致善生物科技股份有限公司)檢測利福平和異煙肼的耐藥性。利福平耐藥突變檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB507-534核心區(qū)位點(diǎn)的突變。異煙肼耐藥突變檢測ahpC啟動子區(qū)(-44～-30、-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))以及katG315密碼子的突變。所有的PCR反應(yīng)體系均為25μl。實驗操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，并參照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。利福平和異煙肼的每個標(biāo)本有兩個反應(yīng)管，每種突變檢測FAM和TET兩個通道熒光信號，即每個標(biāo)本有4個通道的檢測結(jié)果。操作流程簡述如下：配制PCR反應(yīng)液：取n×19.6μl PCR Mix A和n×0.4μl TB酶混合液加入至1.5mL 離心管內(nèi)，混勻，向每支PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝20μl，再加入5μl相應(yīng)提取樣品或陽/陰性對照，PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解分析。

4 線性探針檢測利福平及異煙肼耐藥性

Genolyse?提取DNA：取1mL液化后的痰標(biāo)本，10000g離心15min。棄上清，加入100μl裂解緩沖液(A-LYS)，渦旋振蕩重懸。95℃水浴5min，瞬時離心。加入100μl中和緩沖液(A-NB)振蕩標(biāo)本5min。13000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清(即為DNA模板)至新管中，4℃或-20℃保存。

采用GenoType MTBDR plus 2.0試劑盒(梅里埃公司)檢測利福平和異煙肼的耐藥性。配制PCR反應(yīng)液：實驗步驟嚴(yán)格按照說明書操作。取n×10μl AM-A和n×35μl AM-B混合液加入至1.5mL 離心管內(nèi)，混勻，向每支PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝45μl，再加入5μl相應(yīng)提取樣品或陽/陰性對照，PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。20μl變性液與20μl PCR產(chǎn)物充分混勻，室溫孵育5min，加入1mL雜交緩沖液和標(biāo)記好的探針試紙條，45℃孵育30min，依次加入STR洗脫液、RIN洗脫液進(jìn)行漂洗，加入1：100稀釋的共軛室溫孵育30min，RIN試劑洗脫2次，蒸餾水漂洗1次，基底液避光顯色。每個探針試紙條有27個反應(yīng)區(qū)，包括3個質(zhì)控探針(擴(kuò)增系統(tǒng)質(zhì)控AC、顯色反應(yīng)質(zhì)控CC和23rRNA基因質(zhì)控TUB)和24個檢測探針(1個rpoB基因特異性探針、8個rpoB野生位點(diǎn)探針、4個常見突變位點(diǎn)探針；1個katG基因特異性探針、1個katG野生位點(diǎn)探針、2個katG突變位點(diǎn)探針；1個inhA基因特異性探針、2個inhA野生位點(diǎn)探針、4個inhA突變位點(diǎn)探針)。任一基因野生位點(diǎn)出現(xiàn)條帶，缺失或突變位點(diǎn)出現(xiàn)條帶判定為耐藥；任一基因野生位點(diǎn)出現(xiàn)條帶出現(xiàn)或突變位點(diǎn)缺失，判為敏感。質(zhì)控TUB條帶缺失判為未檢測到結(jié)核分枝桿菌。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以表型藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，計算熒光PCR探針熔解曲線法和線性探針法的敏感度、特異度、符合率。采用Kappa檢驗分析兩種方法檢測結(jié)果一致性(Kappa ≥ 0.8高度一致；0.6≤Kappa<0.8一致性較好；0.4≤Kappa<0.6一致性中等；Kappa<0.4一致性較差)[3]。采用卡方檢驗比較兩種方法檢測結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、表型藥敏試驗結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離株中，其中1份(0.70%)為利福平單耐藥株，16份(11.27%)為異煙肼單耐藥株，27份(19.01%)為同時對利福平和異煙肼耐藥株，98份(69.01%)為敏感株。

二、熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離標(biāo)本中，4份(2.82%)對利福平單耐藥，5份(3.52%)對異煙肼單耐藥，26份(18.31%)同時對利福平和異煙肼耐藥，107份(75.35%)為敏感株。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、符合率及Kappa值結(jié)果(見表1)。

表1 以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥的效能

三、線性探針法檢測結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離標(biāo)本中，110份(77.46%)為敏感株，3份(2.11%)對利福平單耐藥，其中2份rpoB 531突變(S531L)、1份rpoB 526位點(diǎn)突變(H526Y)；7份(4.93%)對異煙肼單耐藥，均為KatG 315點(diǎn)突變(S315T)；22份(15.86%)同時對利福平和異煙肼耐藥，其中1份為rpoBD516V+ KatGS315T突變、1份rpoB516G-T+ KatG315G-C突變、8份rpoBS531L+ KatGS315T突變、1份rpoB 516A-T+ KatG315G-C突變、4份rpoBH526T+KatGS315T突變、2份rpoB531C-T+ KatG315G-C突變、3份rpoB526-529野生型缺失+ KatGS315T突變及2份rpoB513-519野生型缺失+KatGS315T突變。以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針法檢測利福平和異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、符合率及Kappa值結(jié)果(見表2)。

表2 以表型藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)線性探針法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥的效能

四、熒光PCR探針熔解曲線與線性探針技術(shù)檢測結(jié)果的比較(見表3)

表3 探針熔解曲線與線性探針檢測結(jié)果比較

28例利福平臨床結(jié)核桿菌分離耐藥菌株中， PCR熒光熔解曲線技術(shù)檢測利福平耐藥株為26例，線性探針法檢測利福平耐藥株為23例，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.574，P=0.4497)。114例利福平敏感菌株中，熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測利福平敏感株為110株，線性探針法檢測利福平敏感株為112株，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.1667，P=0.6831)。在異煙肼耐藥檢測上，這兩種分子方法檢測結(jié)果比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥性主要發(fā)生在特定基因組的堿基突變引起的，包括藥物靶點(diǎn)的基因或藥物活性有關(guān)的酶基因。約95%的利福平耐藥菌株是由rpoB基因上81bp的耐藥決定區(qū)突變所致，約80%以上的異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌發(fā)生在katG 315密碼子、inhA啟動子的-15和-8位或ahpC啟動子區(qū)域的-6～-47位點(diǎn)的堿基突變[4]。隨著對耐多藥結(jié)核病耐藥機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，分子診斷技術(shù)逐漸成為耐藥結(jié)核病快速診斷的發(fā)展趨勢。熒光PCR探針熔解曲線法是PCR和熔解曲線分析方法的結(jié)合，由于野生型序列具有自身特定的熔點(diǎn)，當(dāng)基因突變時探針結(jié)合力下降導(dǎo)致熔點(diǎn)下降，通過監(jiān)測熒光雜交信號區(qū)分出野生型與突變型。線性探針技術(shù)是由德國Hain Lifescience公司推出的一種基于多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固化在試紙條上的特異性探針反向多位點(diǎn)DNA雜交，通過雜交條帶的顯色情況判斷結(jié)核菌株對利福平耐藥相關(guān)基因rpoB和異煙肼耐藥基因KatG、inhA基因啟動子的野生型及突變型，判斷是否耐藥。這兩種分子技術(shù)方法可用于一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼耐藥突變的檢測，在制定耐藥結(jié)核病的治療方法和管理上具有重要的使用價值。

本文以表型藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法對142例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株檢測利福平耐藥的敏感性和特異性與文獻(xiàn)報道基本一致[5-6]。該方法對異煙肼耐藥的特異性和符合率高，但敏感性略低于以往文獻(xiàn)報道[7-8]，可能因為試劑盒只涵蓋80%耐藥檢測位點(diǎn)及低水平耐藥等因素相關(guān)。不同文獻(xiàn)報道線性探針檢測結(jié)核耐藥性的敏感性和特異性存在著差異，本文以表型藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針法對142例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，檢測利福平耐藥的敏感性和特異性與文獻(xiàn)報道基本一致[9-11]，但對異煙肼耐藥檢測的敏感性不同文獻(xiàn)報道不一致，與一些文獻(xiàn)基本一致[11- 12]，卻低于其他文獻(xiàn)報道[9-10]。本文線性探針法檢測利福平耐藥菌株中發(fā)生rpoB S531L最常見，其次為rpoB 526位點(diǎn)和rpoB 516位點(diǎn)。異煙肼耐藥菌株中最常見的突變位點(diǎn)為KatG S315T。線性探針檢測利福平和異煙肼耐藥性的常見突變耐藥位點(diǎn)與文獻(xiàn)報道相符合[13]。這兩種分子生物學(xué)技術(shù)對異煙肼耐藥性檢測的敏感性均低于表型藥敏試驗，分析其原因：異煙肼耐藥機(jī)制很復(fù)雜，還存在其他耐藥機(jī)制及低水平耐藥情況；兩種分子檢測方法所使用的試劑盒未能完全涵蓋異煙肼耐藥的所有突變位點(diǎn)等因素有關(guān)。另外結(jié)核桿菌壁堅硬，裂解較困難，提取DNA效率不高、DNA濃度不夠可能是導(dǎo)致這兩種分子方法出現(xiàn)無效檢測現(xiàn)象的原因。

表型藥敏試驗耗時長、操作復(fù)雜，分子生物學(xué)技術(shù)可將結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的診斷時間明顯縮短。相對于線性探針方法，熒光PCR探針熔解曲線法操作時間短、獲得結(jié)果更快速、閉管操作減少DNA污染及結(jié)果判讀自動化等優(yōu)點(diǎn)[14]；而線性探針法檢測可以獲得利福平和異煙肼耐藥基因突變的具體位點(diǎn)。本研究中熒光PCR探針熔解曲線和線性探針兩種分子生物學(xué)方法，對利福平和異煙肼耐藥性的檢測具有同等的檢驗效能，與表型藥敏試驗符合率高，一致性較好，可以早期快速診斷耐藥結(jié)核病，值得臨床推廣。