林大成，唐婉婷，覃 媚,2，李 瑩,2

1.北部灣大學 食品工程學院，廣西 欽州 535011

2.北部灣大學 廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室，廣西 欽州 535011

3.北部灣大學 欽州市特色果蔬發(fā)酵重點實驗室,廣西 欽州 535011

仙草又名仙人草、涼粉草(MesonachinensisBenth，Mesona Blume)，是一種富含仙草多糖(仙草膠)的藥食兩用植物[1]，也是生產(chǎn)天然、營養(yǎng)、保健食品的理想原料，具有較高的加工利用價值。由于仙草含有豐富的活性物質, 如仙草多糖、花青素及三萜類等成分[2]，因此，以仙草為原料加工的食品被報道具有一定的抗氧化功能[3-5]，其中含仙草提取物的貢丸具有抑制脂質過氧化作用[6]，仙草乳酸菌飲料具有對DPPH自由基清除作用[7]，仙草多糖還具有顯著的抗氧化作用[8-9]。仙草制品的應用主要有仙草凍與半固體飲料[1,10-11]，而利用乳酸菌發(fā)酵酸奶仙草凍則很少有相關的研究報道,尤其是其抗氧化活性與仙草多糖含量的相關性，以及微生物發(fā)酵胞外多糖、中藥多糖及仙草多糖的總抗氧化活性，即微生物與植物二者所含活性植物化學物質(phytochemicals)的復合多糖所表現(xiàn)的總抗氧活性[12]等方面的報道更為少見?？偠嗵蔷哂锌寡趸映尚Ч? 頗具研究意義, 可為食物全營養(yǎng)的總抗氧化活性研究提供理論基礎[12]。作者采用中藥促進微生物乳酸菌發(fā)酵仙草，得到其發(fā)酵產(chǎn)物為胞外多糖、中藥多糖及仙草多糖的復合多糖，驗證其抗氧化保健功效為三者的加成效果，能大幅提高食品的營養(yǎng)價值、改善風味、提升保健作用，為休閑保健食品的應用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑涼粉仙草: 廣西宇峰保健食品有限公司；中藥(山藥、枸杞、紅景天): 湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司；嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、 優(yōu)質白砂糖及全脂奶粉等混合乳酸菌種：食品級，市售，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、鐵氰化鉀、亞油酸、硫酸氰氨、菲洛嗪(Ferrozine)、Folin-Ciocalteau試劑及乙二胺四乙酸(Sigma)：西安熱默爾生物科技有限公司；乙醇、抗壞血酸、苯酚、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化亞鐵及磷酸鹽緩沖液(pH 6.6、pH 7.4)等：分析純， 廣州柏研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

U-3900型紫外-可見光分光光度計：日本Hitachi日立公司；TG16 MW型臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；KTNK-80型冷凍干燥機：上海喬楓實業(yè)有限公司；CelluSep T2管狀透析膜(MWCO 18～20 kDa)：上海通善生物科技有限公司。

1.3 單因素試驗與正交試驗

稱取仙草粉10 g,奶粉5 g及經(jīng)熬煮的中藥濃縮液加糖水混合。首先，進行單因素試驗，然后，選取糖添加量(12%、14%、16%、18%、20%)、中藥添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌種添加量(8%、10%、12%、14%、16%)和發(fā)酵時間(4、6、8、10、12 h)為考察因素，再進行四因素三水平L9(34)的正交優(yōu)化試驗。

1.4 酸奶仙草凍質量感官評價

酸奶仙草凍感官評分方法參考文獻[13]，并稍加修改。由3組各10名感官評定員，對不同處理樣品進行感官評定。成品質量感官評價指標包括4個方面：組織狀態(tài)、口感滋味、發(fā)酵風味和外觀色澤。評價標準見表1。

表1 酸奶仙草凍感官評價標準

1.5 酸奶仙草凍加工工藝

原料(仙草粉、奶粉、糖酸配料)→蒸餾水→攪拌成糊→低溫滅菌62 ℃, 35 min→冷卻→接種乳酸菌→42 ℃發(fā)酵培養(yǎng)→煮沸100 ℃, 2～3 min→靜置冷卻→成品→感官評定→包裝→低溫保藏。

1.6 復合多糖的提取

采用醇沉法[14]并略加修改, 以正交試驗最佳組合酸奶仙草凍為試驗組(EX), 僅添加乳酸菌發(fā)酵為控制組(CL), 僅添加中藥為對照組(CK)及純酸奶仙草凍為空白組(BK)分別提取酸奶仙草凍的多糖。將制得新鮮酸奶仙草凍攪碎取汁1.0 mL，稀釋10倍加入4倍體積乙醇沉淀，于4 ℃靜置 24 h, 然后在4 ℃下5 000g離心15 min。 沉淀物溶于純水后使用管狀透析膜(MWCO 18～20 kDa)透析24 h，透析液在冷凍干燥機中凍干、磨粉后儲存在-80 ℃下備用。

1.7 復合多糖溶液的抗氧化功能

以正交試驗最佳的組合分別進行抗氧化功能試驗?？寡趸δ茉u估采用DPPH清除能力、還原力、亞鐵離子螯合作用及亞油酸過氧化抑制作用等指標, 測定方法參考文獻[14]。其中陽性對照組(positive control, PC):亞鐵離子螯合作用為EDTA，其余3項為維生素C。

1.8 數(shù)據(jù)分析

抗氧化功能指標的各項試驗都采用Duncan法多重比較，分析統(tǒng)計顯著性差異。各試驗樣品質量濃度為10 mg/mL，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 酸奶仙草凍單因素試驗(圖1)

2.1.1 糖添加量對品質的影響

糖添加量對酸奶仙草凍感官評分的影響如圖1a所示，隨著糖添加量的增加，酸奶仙草凍的感官評分呈先上升后下降趨勢。糖添加量的變化主要影響了乳酸菌的發(fā)酵作用，產(chǎn)生酸性滋味，當添加量為16%時，酸奶仙草凍感官評分最高，為(84.3±3.1)分，與其他添加量的評分比較具有顯著差異(P<0.05)，此時產(chǎn)品酸甜適中，口感良好，無澀味, 表面光滑，組織狀態(tài)均勻細膩。當糖添加量大于16%時，促進乳酸菌大量繁殖產(chǎn)生過多乳酸，導致pH值下降反而抑制生長，此時酸甜失調(diào)，組織因過酸而崩解，口感不佳。由于糖是提供乳酸菌生長的主要碳源，適量糖可增進乳酸菌正常生長發(fā)酵，提高多糖產(chǎn)量, 可增強酸奶仙草凍的抗氧化功能[15]。

2.1.2 中藥添加量對品質的影響

中藥添加量對酸奶仙草凍感官評分的影響如圖1b所示。隨著中藥添加量的增加，酸奶仙草凍的感官評分呈現(xiàn)下降趨勢。初始中藥濃度不高，口感尚佳，風味良好，組織狀態(tài)均勻度一般，凝固效果一般。當中藥添加量超過1%時，稍有苦味，風味不佳，口感變差，稍有澀味,凝固效果稍差，有輕微的顆粒感，表面有少量的波紋或坑洞。故最適中藥添加量為1%，此時酸奶仙草凍的感官評分最高，為(85.0±2.4)分，除添加量2%與3%外，與其他添加量的評分具有顯著差異(P<0.05)。添加適量中藥可激發(fā)乳酸菌的酶類生化反應、強化發(fā)酵，提升多糖產(chǎn)量,復合多糖可增加細胞內(nèi)抗氧化酶活性，提高酸奶仙草凍的抗氧化功能[15-18]。

2.1.3 菌種添加量對品質的影響

菌種添加量對酸奶仙草凍感官評分的影響如圖1c所示，隨著菌種添加量的增加，酸奶仙草凍的感官評分呈先上升后下降趨勢。菌種添加量達12%時，發(fā)酵風味最佳，菌種間良性競爭，生長穩(wěn)定，色澤均勻一致，有利于胞外多糖的產(chǎn)生；當菌種添加量大于12%時, 菌種過量發(fā)生競爭，生長逐漸失衡, 色澤濃郁不均，發(fā)酵風味不佳，故最適菌種添加量為12%，此時酸奶仙草凍的感官評分最高，為(84.5±3.6)分，除添加量為10%與14%外，與其他菌種添加量的評分具有顯著差異(P<0.05)。適量菌種可使生長穩(wěn)定并促進乳酸菌發(fā)酵增加多糖產(chǎn)量, 也可提升酸奶仙草凍的抗氧化能力[15-16]。

注：曲線上不同字母代表有顯著差異(P<0.05)。

2.1.4 發(fā)酵時間對品質的影響

發(fā)酵時間對酸奶仙草凍感官評分的影響如圖1d所示，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸仙草凍的感官評分呈先逐步上升后下降趨勢。初始發(fā)酵時間較短時，發(fā)酵不充分，風味不足,口感不佳；當發(fā)酵時間過長時，釋放出乳酸導致酸度過高，穩(wěn)定稍差并有松垮現(xiàn)象。故最適發(fā)酵時間為10 h，此時乳酸仙草凍的感官評分最高，為(92.9±4.2)分，除8 h與12 h外，與其他發(fā)酵時間的評分具有顯著差異。一般乳酸菌發(fā)酵時間以24 h內(nèi)為黃金時間，配合添加量的提升可縮短約一半的發(fā)酵時間，這與王志江等[13]研究得到產(chǎn)品的制備條件為菌種添加量7%、42 ℃下發(fā)酵8 h類似，也屬合理可行。

2.2 酸奶仙草凍正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果,選取糖添加量(A)、中藥添加量(B)、菌種添加量(C)及發(fā)酵時間(D)進行四因素三水平的L9(34)正交優(yōu)化試驗，正交試驗及極差分析結果如表2所示。各因素對酸奶仙草凍感官評分影響的主次順序為B>A>C>D，最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即糖添加量16%、中藥添加量1%、菌種添加量12%及發(fā)酵時間12 h。較多的糖添加量可促進乳酸菌生長，菌種添加量稍增加可使發(fā)酵時間縮短,并可產(chǎn)生一定風味，同時產(chǎn)生較多的胞外多糖，與仙草膠交互作用可強化仙草多糖的膠凝性[19-20]，促進質地組織的彈性口感[21-22],而少量的中藥可促進乳酸菌的發(fā)酵作用并生成仙草凍的甘味性，但過量則會有苦澀味, 影響口感、色澤。

表2 正交試驗結果與分析

2.3 方差分析

由表 3可知，在不考慮交互作用的情況下，發(fā)酵時間對酸奶仙草凍品質的感官評分有顯著影響，糖添加量、中藥添加量及菌種添加量3個因素都表現(xiàn)為極顯著影響。F值大小順序：B>A>C>D，即對產(chǎn)品感官評分的影響因素大小順序：中藥添加量>糖添加量>菌種添加量>發(fā)酵時間，與正交試驗結果相符。

表3 酸奶仙草凍正交試驗的方差分析

2.4 抗氧化保健效果與機理

抗氧化保健效果以DPPH自由基清除能力、還原力、亞鐵離子螯合作用及亞油酸過氧化的抑制作用等抗氧化指標作為評估依據(jù),為體現(xiàn)仙草多糖、中藥多糖及乳酸菌胞外多糖三者經(jīng)發(fā)酵作用形成復合多糖的抗氧化加成作用, 以多糖含量說明抗氧化活性的疊加效果。

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基清除能力可作為抗氧化劑的強弱指標, 是維持人體內(nèi)自由基平衡的重要因素之一[14]。 以最佳組合所制酸奶仙草凍對DPPH自由基清除能力如圖2所示, 由圖2可知，添加中藥的試驗組(EX)(90.50±3.60)%均比僅添加乳酸菌發(fā)酵的控制組(CL)(47.33±1.87)%、僅添加中藥的對照組(CK)(43.17±1.81)%及不經(jīng)乳酸菌發(fā)酵純酸奶仙草凍的空白組(BK)(37.80±2.20)%具有顯著較高的DPPH自由基清除能力(P<0.05), 其中，EX的效果是CL的1.8～2.1倍、是CK的1.9～2.3倍、是BK的2.2～2.6倍, 說明最佳試驗組含有的中藥能提高乳酸菌發(fā)酵酸奶仙草凍對DPPH 自由基的清除能力,這可能是仙草所含多糖、多酚、萜類及類黃酮等抗氧化物質, 因中藥促進乳酸菌發(fā)酵在生化反應中釋放而增加[13,17]。仙草多糖能提高抗氧化酶GSH-Px、SOD 及 CAT 的活性，且呈現(xiàn)一定的量效關系[23]。Tang等[8]研究仙草多糖3種活性物質，其中利用酶所提取的抗氧化活性物質，可獲得對DPPH自由基清除能力最大的抗氧化活性，其值為(88.91±1.44)%，與本研究相當，顯示以中藥促進乳酸菌發(fā)酵的酶生化反應系統(tǒng)與其具有相同的效果。

2.4.2 還原力

還原力(RP)可作為抗氧化劑能力的評估指標之一，以最佳組合所制酸奶仙草凍的還原力如圖2所示。由圖2可知，添加中藥的試驗組(EX)(0.93±0.08,A700)均比僅添加乳酸菌發(fā)酵的控制組(CL)(0.49±0.04,A700)、僅添加中藥的對照組(CK)(0.42±0.02)及不經(jīng)乳酸菌發(fā)酵純酸奶仙草凍的空白組(BK)(0.37±0.02,A700)具有顯著較高的還原力(P<0.05), 其能力的強弱大致為EX>CL>CK>BK, 其中，EX的效果是CL的1.6～2.2倍、是CK的1.9～2.5倍、是BK的2.2～2.9倍, 說明最佳組合EX含有的中藥可提高乳酸菌發(fā)酵酸奶仙草凍對還原力的促進作用, 可能是仙草所含多糖、多酚及黃酮等還原物質, 因乳酸菌發(fā)酵生化反應而增加[13,17], 此與文獻報道還原力的量效呈現(xiàn)正向關系相符[8]。

2.4.3 亞鐵離子螯合作用能力

亞鐵離子螯合作用能力(FC)也可作為抗氧化劑能力的評估指標之一，是由于過渡金屬在脂質氧化過程中具有催化作用。亞鐵在過渡金屬中具有相當高的反應活性，因此成為最重要的脂類氧化促進劑，對亞鐵離子的螯合作用，免于金屬螯合活性促進脂質過氧化，是一種抗氧化機制的體現(xiàn)[23]。最佳組合所制酸奶仙草凍對亞鐵離子螯合作用的能力如圖2所示，可知最佳組合的試驗組(EX)(73.40±6.50)%均比僅添加乳酸菌發(fā)酵的控制組(CL)(38.48±3.38)%、 僅添加中藥的對照組(CK)(33.27±1.65)%及不經(jīng)乳酸菌發(fā)酵純酸奶仙草凍的空白組(BK)(29.57±0.95)%具有顯著較高的亞鐵離子的螯合作用能力(P<0.05), 其能力的強弱大致為EX>CL>CK>BK，其中，EX的效果是CL的1.6～2.3倍、是CK的1.9～2.5倍、是BK的2.2～2.8倍，說明最佳試驗組含有的中藥可促進乳酸菌發(fā)酵酸奶仙草凍對亞鐵離子的螯合作用能力[17]。Tang等[8]研究仙草粗多糖也顯示其具有良好的Fe2+螯合能力，與林麗莎等[5]研究報道一致。

2.4.4 亞油酸過氧化的抑制作用能力

以最佳組合所制酸奶仙草凍的亞油酸過氧化的抑制作用能力(AOA)如圖2所示。由圖2可知，最佳組合的試驗組(EX)(57.80±4.80)%均比僅添加乳酸菌發(fā)酵的控制組(CL)(28.13±1.24)%、 僅添加中藥的對照組(CK)(26.70±1.11)%及純酸奶仙草多糖的空白組(BK)(23.67±1.47)% 具有顯著較高的亞油酸過氧化的抑制作用能力(P<0.05), 其能力的強弱大致為EX>CL>CK>BK，其中，EX的效果是CL的1.8～2.3倍、是CK的1.9～2.4倍、是BK的2.1～2.8倍，說明最佳試驗組含有的中藥可提高乳酸菌發(fā)酵酸奶仙草凍對亞油酸過氧化的抑制作用能力，可能是仙草所含多糖、黃酮類、酚類化合物等抗氧化物質, 因乳酸菌發(fā)酵生化反應而被釋放出來[8,12]。仙草多糖增加細胞內(nèi)抗氧化酶活性，可降低脂質過氧化物生成[5]，Tang等[8]研究指出仙草多糖比維生素 E、二丁基羥基甲苯(bibutyl hydroxy toluene, BHT) 具更強的抗氧化作用, 可抑制脂質過氧化物的形成[5,8,23]。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 總多糖與抗氧化活性的關系分析

試驗組(EX)總多糖的總抗氧化活性為胞外多糖(CL)、中藥多糖(CK)及仙草多糖(BK)之和, 顯示中藥可能含有某些生物活性因子以激發(fā)乳酸菌發(fā)酵的酶類生化反應系統(tǒng)，促進多糖產(chǎn)量增加[14,17]，增強抗氧化活性。由圖2可知，DPPH自由基清除能力(90.50±3.60)%、還原力(0.93±0.08，A700)、 亞鐵離子螯合作用(73.40±6.50)%及亞油酸過氧化的抑制作用(57.80±4.80)%分別有顯著的差異效果(P<0.05)。EX的4種抗氧化指標大約為乳酸菌胞外多糖(CL)、中藥多糖(CK)及仙草多糖(BK)三者的疊加效果; 且由表4可知，4種抗氧化指標的曲線皆符合菲克定律(Fick’s law)，4個指標的R2值都在0.941 5～0.968 7之間，依菲克定律意義指出各多糖濃度為其總量之和即有加成作用[24], 此與文獻[25]研究結果一致，該研究利用中藥促進微生物發(fā)酵作用的效果, 與前人利用加熱或酸水解釋出更多的活性物質的效果相當, 可提升抗氧化活性，表現(xiàn)加成作用，以大幅增進保健效果[12,26]，故復合多糖約為乳酸菌的胞外多糖、中藥多糖及仙草多糖三者的總和，其抗氧化活性表現(xiàn)亦為三者的疊加總和效果。

表4 試驗組復合多糖中4種抗氧化指標的總和效果

3 結論

為開發(fā)高質量和保健功能的酸奶仙草凍，利用中藥促進乳酸菌發(fā)酵仙草膠, 使形成活性乳酸菌發(fā)酵胞外多糖、中藥多糖及仙草多糖三者結合的復合多糖，以期大幅提升抗氧化保健功能。結果顯示最佳工藝條件：糖添加量16%、中藥添加量1%、菌種添加量12%及發(fā)酵時間12 h。最佳抗氧化保健效果：DPPH自由基清除能力(90.50±3.60)%、還原力(0.93±0.08，A700)、亞鐵離子螯合作用(73.40±6.50)%及亞油酸過氧化的抑制作用(57.80±4.80)%等抗氧化指標，皆顯著高于控制組、對照組及空白組(P<0.05)，且為三者的疊加效果。故中藥可激發(fā)乳酸菌生長的酶類生化反應從而促進活性物質的增加，形成高質量的復合多糖，大幅提升酸奶仙草凍的總抗氧化保健效果。