梁秀俊，趙鳳娟，肖陳貴，賀 星，金華麗，衛(wèi) 敏*

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518000

伏馬菌素B1(Fumonisin B1，F(xiàn)B1)是農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)過(guò)程中主要由鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性真菌毒素。FB1多分布于以玉米為代表的谷物及制品中，能引起家畜急性中毒，損害動(dòng)物免疫系統(tǒng)[1]。相關(guān)的研究表明，F(xiàn)B1的攝入與食管癌的發(fā)生具有較強(qiáng)的相關(guān)性[2]。為保障食品安全和公共衛(wèi)生健康，對(duì)FB1的檢測(cè)方法研究已成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，熒光分析方法因操作簡(jiǎn)便、無(wú)須復(fù)雜的樣品前處理、分析速度快而受到青睞。作為新型“化學(xué)抗體”，核酸適配體是在體外合成的能夠以高親和力和高特異性結(jié)合目標(biāo)分子的單鏈DNA或RNA[3]。因其具有穩(wěn)定性好、易于合成、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，已作為新型識(shí)別探針用于構(gòu)建熒光傳感器以提高檢測(cè)方法的選擇性及穩(wěn)定性[4]。

石墨烯具有獨(dú)特的吸附單鏈DNA (ssDNA)能力和熒光猝滅性能，在熒光傳感器構(gòu)建中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[5-6]。研究表明，雜原子的取代不僅能有效地調(diào)節(jié)石墨烯電子結(jié)構(gòu)，改善其物理化學(xué)性質(zhì)，優(yōu)化其多方面的性能。由于氮原子具有與碳原子近似的原子半徑和強(qiáng)的價(jià)鍵，使它成為碳基材料化學(xué)摻雜的合適選擇，氧官能團(tuán)被含氮酰胺基取代并形成了氮與碳原子的共價(jià)鍵，生成的氮摻雜石墨烯(Nitrogen doped graphenes, NDGRs)，表現(xiàn)出諸多優(yōu)良的性能，例如，Siddiqui等[7]基于NDGRs對(duì)熒光染料羅丹明B (RhB)的吸附作用，建立檢測(cè)過(guò)氧化氫濃度的傳感策略，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NDGRs增強(qiáng)了熒光淬滅和吸附能力，所建立的傳感策略表現(xiàn)出良好的特異性。Dou等[8]采用DNA模板原位合成方法，在NDGRs上原位生長(zhǎng)AuNPs，材料的分散性和催化活性顯著提高，所構(gòu)建的傳感器用于監(jiān)測(cè)活癌細(xì)胞釋放的一氧化氮，體外監(jiān)測(cè)能達(dá)到亞摩爾級(jí)別的檢測(cè)限。目前，氮摻雜石墨烯與核酸適配體結(jié)合用于構(gòu)建熒光傳感策略的研究還未見報(bào)道。RecJfExo是一種從5′到3′方向剪切ssDNA特異性核酸外切酶，它還能從5′末端逐步水解適配體靶標(biāo)復(fù)合物中的DNA鏈[9]。這一特性已被用來(lái)開發(fā)高靈敏度適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大策略。

作者結(jié)合核酸適配體親和性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、成本低的特點(diǎn)，借助RecJfExo催化剪切核酸適配體/靶標(biāo)復(fù)合物的能力實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增，建立分析步驟簡(jiǎn)單、靈敏度與穩(wěn)定性較高的新型熒光傳感器分析方法，用于FB1的檢測(cè)研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

FB1的核酸適配體 (FAM-Aptamer)：5′-FAM- ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3′ ，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。FB1和RecJf外切酶分別購(gòu)買于Acros公司和北京紐英倫生物科技有限公司。試驗(yàn)所用的熒光儀器為日立F-7100熒光分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 傳感器的制備及對(duì)FB1的熒光檢測(cè)

NDGRs的制備參照參考文獻(xiàn)[10]。將一定量的石墨烯與三聚氰胺按物質(zhì)的量1∶ 1混合后置于管式爐，在氮?dú)夥諊?00 ℃處理2 h，冷卻至室溫，即可得到NDGRs。

將25 μL、40 μg/mL的NDGRs溶液與10 μL、1 μmol/L的FAM-Aptamer探針混合，并于37 ℃下溫和振蕩孵育30 min，使FAM-Aptamer探針吸附到NDGRs表面。孵育完成后向上述體系中同時(shí)加入10 μL、1 000 ng/mL的FB1與5 μL、1 U/μL RecJfExo，使用1×NE Buffer 2緩沖液將反應(yīng)體系補(bǔ)充至200 μL，再溫和振蕩孵育120 min后進(jìn)行熒光掃描。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量范圍500～600 nm，記錄520 nm下的熒光強(qiáng)度。F0表示測(cè)量體系在不加入FB1時(shí)所獲得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示加入FB1時(shí)所獲得的熒光強(qiáng)度。

1.2.2 實(shí)際樣品檢測(cè)

將未受污染的玉米樣品經(jīng)研磨制成粉末，取5.0 g粉末并加入不同濃度的FB1，然后與25 mL萃取溶劑(甲醇與水的體積比為7∶ 3)混合，置于振蕩器振蕩30 min后，將所得物以5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾上清液，使用1×NE Buffer 2緩沖液將濾液稀釋至100倍。根據(jù)上述預(yù)處理方法，分別制備出5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加標(biāo)玉米樣品提取液。

取適量的啤酒于100 mL燒杯中，將其充分超聲處理去除二氧化碳等氣泡。稱取5 mL啤酒樣品與不同質(zhì)量濃度的FB1溶液混合于50 mL離心管中，加入20 mL的1×NE Buffer 2緩沖液，充分混合后直接用0.45 μm的水系濾膜過(guò)濾，并收集樣品處理濾液。取適量樣品處理濾液并用1×NE Buffer 2緩沖液將上清液稀釋至100倍，制備5 ng/mL、50 ng/mL和500 ng/mL的FB1加標(biāo)啤酒樣品提取液。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于NDGRs與RecJf Exo的熒光傳感器對(duì)FB1的檢測(cè)原理

如圖1所示，當(dāng)傳感體系中不存在FB1時(shí)，NDGRs既是作為負(fù)載FB1核酸適配體識(shí)別探針FAM-Aptamer的物理基底，也是一種熒光猝滅材料。單鏈FAM-Aptamer核酸堿基芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和NDGRs結(jié)構(gòu)六角晶胞間產(chǎn)生強(qiáng)烈的π-π堆積作用，使其能夠吸附在NDGRs表面，熒光基團(tuán)靠近NDGRs導(dǎo)致其熒光猝滅[11]。當(dāng)加入FB1時(shí)，F(xiàn)B1與FAM-Aptamer特異性結(jié)合，F(xiàn)AM-Aptamer的構(gòu)象發(fā)生變化并從NDGRs表面脫離形成FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物，F(xiàn)AM基團(tuán)遠(yuǎn)離NDGRs，其熒光強(qiáng)度就會(huì)恢復(fù)。利用RecJfExo特異性剪切FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物中單鏈FAM-Aptamer的能力，F(xiàn)AM-Aptamer被水解從而釋放出FB1，同時(shí)因FAM-Aptamer被水解成了單核苷酸片段[12]，F(xiàn)AM熒光基團(tuán)也游離于傳感體系之中。釋放出的FB1再次和吸附于NDGRs表面的FAM-Aptamer發(fā)生特異性結(jié)合，形成下一次循環(huán)。RecJfExo的剪切靶標(biāo)復(fù)合物的循環(huán)作用使得游離于傳感體系的FAM熒光基團(tuán)增多，導(dǎo)致熒光信號(hào)明顯增大。

圖1 基于NDGRs與RecJf Exo的傳感器制備檢測(cè)FB1原理

2.2 NDGRs的表征

利用掃描電鏡和透射電鏡對(duì)制備的NDGRs進(jìn)行形貌表征，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯鯪DGRs的薄片層狀結(jié)構(gòu)清晰明顯，表面存在略微褶皺，大小為1～2 μm。

圖2 氮摻雜石墨烯的掃描電鏡形貌和透射電鏡形貌

利用X射線光電子能譜(XPS)對(duì)NDGRs進(jìn)行物質(zhì)元素的定性分析，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，材料中含有C、N、O 3種元素，531 eV、399 eV和285 eV處的信號(hào)峰分別代表O 1 s、N 1 s和C 1 s。此外，N 1 s光譜在401.5、400.1和398.7 eV處有3個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于石墨-N、吡咯-N和吡啶-N。XPS分析表明，部分N元素已經(jīng)嵌入到NDGRs材料結(jié)構(gòu)中，N含量約為5.53%。

圖3 NDGRs的X射線光電子能譜(XPS)分析

2.3 NDGRs的用量對(duì)FAM-Aptamer熒光探針猝滅性能的影響

NDGRs的用量對(duì)FAM-Aptamer熒光探針猝滅性能的影響如圖4所示。從圖4 A可看出，隨著材料質(zhì)量濃度的增加，猝滅效率逐漸增加，所獲得的熒光強(qiáng)度逐漸減弱最終趨于平緩。當(dāng)NDGRs質(zhì)量濃度達(dá)到40 μg/mL時(shí)，超過(guò)80%的熒光信號(hào)被淬滅，說(shuō)明使用較多的NDGRs可使單鏈FAM-Apatmer信號(hào)探針被更有效地吸附到材料表面。猝滅效率隨NDGRs質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到60 μg/mL之后不再明顯變化。但是，當(dāng)濃度超過(guò)40 μg/mL時(shí)，會(huì)影響其分散性及穩(wěn)定性，并且由光散射所產(chǎn)生的信號(hào)干擾可能會(huì)使傳感器的靈敏度降低[13]。圖4B顯示不同系列質(zhì)量濃度NDGRs存在下加入FB1前后所獲得的熒光強(qiáng)度。內(nèi)插圖為按照(F-F0)/F0計(jì)算不同的NDGRs質(zhì)量濃度下相對(duì)熒光強(qiáng)度比值?？梢钥闯?，隨著NDGRs質(zhì)量濃度的增加，測(cè)量體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度比值先增大后減小，當(dāng)NDGRs質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)，由FB1引起的相對(duì)熒光強(qiáng)度比最大。內(nèi)插圖也反映出使用適當(dāng)多的NDGRs可以更加有效地吸附單鏈FAM-Aptamer，提高猝滅效率。然而，過(guò)量的NDGRs可能會(huì)在FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物周圍，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[14-15]。因此，NDGRs的最佳質(zhì)量濃度為40 μg/mL。

2.4 RecJf Exo用量的優(yōu)化

對(duì)RecJfExo的用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示。熒光強(qiáng)度隨著酶用量的增加而逐漸增加，當(dāng)酶量為5 U時(shí)達(dá)到最大。這可能是由于適配體靶標(biāo)復(fù)合物被催化剪切的效率有所增加，導(dǎo)致越來(lái)越多的FAM熒光基團(tuán)被釋放到傳感體系中。因此，RecJfExo的最佳用量為5 U。

2.5 傳感器對(duì)FB1的檢測(cè)

利用所制備的熒光傳感器對(duì)FB1檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。在傳感體系中僅有NDGRs與FAM-Aptamer信號(hào)探針孵育后，得到的熒光強(qiáng)度較低(曲線a)，說(shuō)明NDGRs對(duì)信號(hào)探針起到了明顯的熒光猝滅，猝滅現(xiàn)象的發(fā)生可能主要是由于FAM熒光基團(tuán)與NDGRs之間的FRET效應(yīng)引起的。同時(shí)也表明了大量的FAM-Aptamer信號(hào)探針被有效吸附到NDGRs表面。在NDGRs與FAM-Aptamer信號(hào)探針孵育后，加入RecJfExo孵育2 h，熒光強(qiáng)度僅略微增加 (曲線b)，說(shuō)明大部分的FAM-Aptamer仍負(fù)載于NDGRs表面，RecJfExo幾乎沒對(duì)信號(hào)探針進(jìn)行水解。該現(xiàn)象證明了NDGRs保護(hù)單鏈寡核苷酸免受RecJfExo剪切的特性。當(dāng)完成NDGRs對(duì)FAM-Aptamer信號(hào)探針負(fù)載后，向傳感體系中引入FB1，經(jīng)30 min孵育后，與未加入FB1時(shí)相比，熒光強(qiáng)度增加了64.7% (曲線c)。說(shuō)明核酸適配體對(duì)FB1的高親和力誘導(dǎo)探針形成了FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物，并導(dǎo)致復(fù)合物從NDGRs材料表面脫離，F(xiàn)AM基團(tuán)熒光恢復(fù)。而當(dāng)NDGRs與FAM-Aptamer信號(hào)探針孵育完成后向傳感體系中同時(shí)加入FB1與RecJfExo，得到的熒光強(qiáng)度相較于曲線c的熒光信號(hào)強(qiáng)度又進(jìn)一步地增加了80.1%(曲線d)，此現(xiàn)象說(shuō)明RecJfExo可以有效剪切FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物中ssDNA，F(xiàn)AM-Aptamer/FB1復(fù)合物解體，F(xiàn)AM熒光基團(tuán)與FB1均游離于傳感體系之中，被釋放的FB1會(huì)重復(fù)參與結(jié)合負(fù)載于NDGRs表面的FAM-Aptamer，進(jìn)而導(dǎo)致更多的FAM熒光基團(tuán)因信號(hào)探針被剪切而游離于傳感體系之中，說(shuō)明RecJfExo剪切適配體靶標(biāo)復(fù)合物引起的靶標(biāo)循環(huán)信號(hào)擴(kuò)增作用有顯著效果。

A.不同質(zhì)量濃度NDGRs與FAM-Aptamer孵育完成后所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；B.不同質(zhì)量濃度NDGRs條件下，NDGRs/FAM-Aptamer測(cè)量體系中加入FB1孵育前后的熒光強(qiáng)度 (內(nèi)插圖為NDGRs質(zhì)量濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度比的關(guān)系)

[FAM-Aptamer]=1 μmol/L；[NDGRs]=40 μg/mL；[FB1]=50 ng/mL

a.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer；b.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+5 U RecJf Exo；c.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1；d.40 μg/mL NDGRs+1 μmol/L FAM-Aptamer+50 ng/mL FB1+5 U RecJf Exo

由圖7可以看出，隨著FB1質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加。當(dāng)FB1的質(zhì)量濃度達(dá)到500 ng/mL以后，熒光強(qiáng)度未明顯變化。FB1質(zhì)量濃度在0.2～20 ng/mL及20～500 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程分別為F=9.02CFB1+192.27 (R2=0.991 5)和F=0.35CFB1+367.71 (R2=0.992 1)，檢出限為0.084 ng/mL (3σ)。與其他文獻(xiàn)的檢出限比較見表1。

2.6 傳感器的特異性研究

利用赭曲霉毒素A(OTA)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)對(duì)所制備傳感器的特異性進(jìn)行研究。 FB1質(zhì)量濃度10 ng/mL，其他干擾毒素OTA、AFB1、ZEN的質(zhì)量濃度均為500 ng/mL。從圖8可以看出，盡管添加其他干擾毒素的濃度是FB1的50倍，但都不能引起傳感器顯著的信號(hào)響應(yīng)，而只要傳感體系中存在FB1，熒光強(qiáng)度就有明顯增加，說(shuō)明該傳感器具有良好的特異性。

曲線由下至上FB1質(zhì)量濃度依次為0、0.1、0.2、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL

表1 所制備傳感器與其他檢測(cè)FB1方法比較

(a)空白；(b)AFB1；(c)OTA；(d)ZEN；(e)FB1；(f)FB1+AFB1；(g)FB1+OTA；(h)FB1+ZEN；[FB1]=10 ng/mL；[AFB1]=[OTA]=[ZEN]=500 ng/mL

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用所制備的傳感器對(duì)FB1加標(biāo)玉米及啤酒檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。加標(biāo)玉米樣品中FB1的平均回收率為91%～103%，加標(biāo)啤酒樣品中FB1的回收率為92%～97%，說(shuō)明制備的傳感器適用于食品中FB1的檢測(cè)。

表2 FB1加標(biāo)樣品的檢測(cè)結(jié)果 (n=6)

3 結(jié)論

利用具有較大比表面積及良好分散性的NDGRs有利于增強(qiáng)傳感器檢測(cè)性能的優(yōu)點(diǎn)，將其作為負(fù)載FB1核酸適配體識(shí)別探針的基底，建立了以RecJfExo催化剪切FAM-Aptamer/FB1復(fù)合物中單鏈FAM-Aptamer釋放FB1，觸發(fā)靶標(biāo)循環(huán)信號(hào)擴(kuò)增傳感策略，實(shí)現(xiàn)了FB1的高靈敏檢測(cè)。同時(shí)，該傳感器對(duì)加標(biāo)玉米及加標(biāo)啤酒樣品的檢測(cè)得到良好的回收率。