吳 帆, 張 莉, 邱一蕾, 李紅亮

(中國計量大學生命科學學院, 浙江省生物計量及檢疫檢驗重點實驗室, 杭州 310018)

在自然界中，昆蟲是地球上種類最多、分布最廣的動物類群，與人類關(guān)系非常密切。據(jù)報道，已命名昆蟲超過100萬種，占節(jié)肢動物門80%以上，超過其他動物物種的總和(Zhang, 2013)。昆蟲之所以能夠在復(fù)雜的自然環(huán)境中脫穎而出，這與其精密復(fù)雜的嗅覺系統(tǒng)密不可分(Leal, 2013)。昆蟲嗅覺系統(tǒng)包括中樞嗅覺系統(tǒng)和外周嗅覺系統(tǒng)兩部分(Ong and Stopfer, 2012)，識別過程有4步：第1步，環(huán)境中氣味或信息素分子通過擴散進入昆蟲(觸角、足等)體表特化的感受器中；第2步，在感受器嗅覺結(jié)合蛋白的協(xié)助下，穿過血淋巴傳遞至外周神經(jīng)樹突細胞膜上的嗅覺受體(Bentonetal., 2007)；第3步，信號分子與嗅覺受體發(fā)生作用，化學信號轉(zhuǎn)化為電信號并激發(fā)樹突神經(jīng)興奮；第4步，樹突神經(jīng)電信號經(jīng)樹突嗅神經(jīng)葉處理傳遞到中樞神經(jīng)，做出相應(yīng)的行為和生理反應(yīng)(Zhou, 2010; Leal, 2013)。

作為嗅覺系統(tǒng)的第一個參與者，嗅覺結(jié)合蛋白發(fā)揮著重要的作用(Pelosietal., 2014a)。嗅覺結(jié)合蛋白主要包括3類：氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)和尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 proteins, NPC2) (Leal, 2013; Pelosietal., 2014a; Zhuetal., 2018)。第一個嗅覺結(jié)合蛋白于1981年在多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中鑒定，之后研究者在多種昆蟲中都有發(fā)現(xiàn)(Vogt and Riddiford, 1981)。本文之前，一些研究者曾對嗅覺結(jié)合蛋白作過綜述(婁永根和程家安, 2001; 王桂榮等, 2002; 萬新龍和杜永均, 2015)。但隨著各種組學及生物信息學等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，嗅覺結(jié)合蛋白的研究發(fā)展尤為迅速，又積累了豐富的知識。截至到目前，在雙翅目、鱗翅目、膜翅目、鞘翅目和半翅目等昆蟲中發(fā)現(xiàn)和鑒定到的嗅覺結(jié)合蛋白已經(jīng)超過600個[根據(jù)Zhou(2010), Leal(2013)和 Pelosi等(2018a)等數(shù)據(jù)修正]，很多蛋白的生化功能和應(yīng)用也得到了深入研究(Zhou, 2010; Britoetal., 2016; Pelosietal., 2018a; 張玉等, 2019)。本文對近年來嗅覺結(jié)合蛋白的分子特性、結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用等方面取得的最新研究進展進行了總結(jié)和綜述。

1 嗅覺結(jié)合蛋白的分子特性、結(jié)構(gòu)和作用機制

嗅覺結(jié)合蛋白是一類低分子量可溶性的親水蛋白，大小在15 kD左右，一般呈酸性。蛋白N端含有十幾個氨基酸的信號肽，用于分泌到胞外發(fā)揮功能。高級結(jié)構(gòu)為球狀，可以和不同的配基分子結(jié)合。

1.1 氣味結(jié)合蛋白

OBPs家族是最早發(fā)現(xiàn)的嗅覺結(jié)合蛋白，數(shù)量多而且最為復(fù)雜。它們最為顯著的特征是豐富的α-螺旋和保守的半胱氨酸(Cys)(圖1: A)(Zhou, 2010)。根據(jù)功能可把OBPs分為：普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant-binding proteins, GOBPs)、性信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)和觸角特異性蛋白(antennae specific proteins, ASPs)，早期研究認為GOBPs主要識別和結(jié)合普通氣味分子，PBPs和ASPs主要識別和結(jié)合昆蟲性信息素，其中ASPs是特異分布于觸角的嗅覺結(jié)合蛋白(Zhouetal., 2009)。但是，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)GOBPs, PBPs和ASPs識別的分子都具有廣譜性，它們既可以識別普通氣味分子也可以識別昆蟲信息素，而且一個配基可以被多種蛋白結(jié)合，只是偏向于與特定的分子結(jié)合來發(fā)揮功能(吳帆等, 2016; Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。所以，OBPs的這種分類方式可能存在一定局限性。

圖1 昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白三維結(jié)構(gòu)模型示例Fig. 1 Examples of the 3D structure of olfactory binding proteins in insectsA: 意大利蜜蜂嗅覺結(jié)合蛋白AmelASP1三維結(jié)構(gòu)3D structure of Apis mellifera ligustica olfactory binding protein AmelASP1 (Pesenti et al., 2008); B: 家蠶化學感受蛋白BmorCSP1三維結(jié)構(gòu)3D structure of Bombxy mori chemosensory protein BmorCSP1 (Jansen et al., 2007); C: 日本弓背蟻尼曼-匹克C2型蛋白CjapNPC2三維結(jié)構(gòu)3D structure of Camponotus japonicus Niemann-Pick type C2 protein CjapNPC2 (Ishida et al., 2014).

根據(jù)保守的半胱氨酸數(shù)量則可把OBPs家族分為：經(jīng)典OBPs(classical OBPs)、多半胱氨酸OBPs(plus-C OBPs)、少半胱氨酸OBP(minus-C OBPs)和非典型OBPs(atypical OBPs)(表1)(Fanetal., 2011)。保守Cys形成的二硫鍵是影響和維持蛋白結(jié)構(gòu)的主要原因之一。一般情況，6個及以上Cys形成3個二硫鍵，而4～5個Cys只形成2個二硫鍵。

表1 根據(jù)半胱氨酸(Cys)殘基數(shù)對昆蟲OBPs家族分類[改自Fan等(2011)]Table 1 Classification of OBPs family according to the number of cysteine (Cys) residues (adapted from Fan et al., 2011)

目前，利用X-射線晶體衍射和核磁共振等技術(shù)在昆蟲中已經(jīng)分析獲得了20多個OBPs的三維結(jié)構(gòu)，相關(guān)信息可以在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB(https:∥www.rcsb.org/)中查詢，它們均是以α-螺旋為基礎(chǔ)的球形結(jié)構(gòu)(Britoetal., 2016; 杜亞麗等, 2020)。

1.2 化學感受蛋白

CSPs是昆蟲中發(fā)現(xiàn)的第2類嗅覺結(jié)合蛋白(圖1: B)。1994年，McKenna等在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中首次發(fā)現(xiàn)CSPs基因，可能與化學感受功能相關(guān)，其蛋白被命名為OS-D (McKennaetal., 1994)。直到1999年，Angeli等在沙漠蝗Schistocercagregaria中發(fā)現(xiàn)類似的序列，確定其與信息素識別相關(guān)，命名為CSPs(Angelietal., 1999)。CSPs分子量較OBPs稍小，但同樣具有α-螺旋和保守的Cys。CSPs一般只存在4個保守的Cys位點，形成2個二硫鍵來維持三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Sanchez-Graciaetal., 2009)。相對于OBPs，CSPs在進化上高度保守，不同物種間相似性也很高，比例高達40%～50%，高度保守性可能是CSPs數(shù)量比OBPs少的原因之一(Wanneretal., 2004)。CSPs編碼基因在物種基因組中常常成簇出現(xiàn)，這也支持它們可能由相同基因進化而來的觀點。在不同物種中，CSPs數(shù)量相差較大，如意大利蜜蜂Apismelliferaligustica有6個，家蠶Bombyxmori有22個(Foretetal., 2007; Gongetal., 2007)。目前，在昆蟲中僅有甘藍夜蛾MamestrabrassicaeMbraCSP2(MbraCSPA6)、沙漠蝗SgreCSP4和家蠶BmorCSP1(圖1: B)3個CSPs蛋白結(jié)構(gòu)獲得解析(Lartigueetal., 2002; Tomasellietal., 2006; Jansenetal., 2007)。

1.3 尼曼-匹克C2型蛋白

NPC2最早是在脊椎動物中鑒定的蛋白，主要功能是負責轉(zhuǎn)運膽固醇和脂類物質(zhì)，與一些膽固醇異常的疾病發(fā)生相關(guān)(Storch and Xu, 2009)。后來，研究者在節(jié)肢動物門中的多個物種中發(fā)現(xiàn)NPC2，其中以螯肢動物最具有代表性，且昆蟲NPC2分析表明其功能與OBPs有較高的相似性(Pelosietal., 2014a)，進而被認為是第3類具有昆蟲嗅覺結(jié)合功能的蛋白。進化分析顯示NPC2在節(jié)肢動物中是比OBPs和CSPs更早出現(xiàn)的可溶性蛋白分子(Vizuetaetal., 2020)。與OBPs和CSPs不同的是，昆蟲中NPC2二級結(jié)構(gòu)主要為β折疊(圖1: C)，在此基礎(chǔ)上形成了比OBPs和CSPs更大的內(nèi)部結(jié)合腔(Ishidaetal., 2014)。同時，NPC2序列中也存在保守的Cys，數(shù)量在4～6個不等，可以形成2～3個二硫鍵來維持其穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)(Zhuetal., 2018)。目前，在昆蟲中僅有日本弓背蟻Camponotusjaponicus的CjapNPC2蛋白三維結(jié)構(gòu)得到解析(Ishidaetal., 2014)。我們知道，OBPs和CSPs在昆蟲中的二級結(jié)構(gòu)主要是α螺旋，在哺乳動物中主要是β折疊(Pelosietal., 2014a)。但是，NPC2在昆蟲和哺乳動物中的二級結(jié)構(gòu)都是以β折疊為主。

1.4 影響嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的外界因素

除了蛋白序列外，嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)還會受到其他因素的影響。第一，pH影響蛋白結(jié)構(gòu)。對意大利蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBP1結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在pH為4.0, 5.5和7.0時，其結(jié)構(gòu)和對配基的結(jié)合力都存在差異，在低pH時OBP1對蜂王信息素9-ODA結(jié)合力更強(Pesentietal., 2008)。這一結(jié)果與家蠶性信息素結(jié)合蛋白BmorPBP和岡比亞按蚊Anophelesgambiae氣味結(jié)合蛋白AgamOBP1相反，它們在高pH時的結(jié)構(gòu)更利于配基結(jié)合(Leeetal., 2002; Wogulisetal., 2006)。當?shù)竭_嗅覺受體后，通過pH調(diào)節(jié)還可以促使氣味結(jié)合蛋白釋放配基來激活受體，這種通過pH調(diào)節(jié)結(jié)合力的現(xiàn)象對它們發(fā)揮功能十分重要(Yuetal., 2018)。第二，配基結(jié)合影響蛋白結(jié)構(gòu)。意大利蜜蜂OBP14在與1-NPN、丁香酚、檸檬腈和溴化鉭等配基結(jié)合后，其自身結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變(Spinellietal., 2012)。由于氣味結(jié)合蛋白經(jīng)常以二聚體形式發(fā)揮作用，這就導致一個配基結(jié)合后可能會影響其他配基的結(jié)合(Weietal., 2020)。第三，氨基酸位點突變影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能。蛋白質(zhì)氨基酸序列決定其高級結(jié)構(gòu)，所以氨基酸突變會影響蛋白構(gòu)象，改變其配基結(jié)合力，特別是重要的氨基酸(Lietal., 2020)。比如，保守的Cys和能形成氫鍵的氨基酸改變對蛋白結(jié)合功能有重要影響(Spinellietal., 2012; Songetal., 2018)。研究表明，嗅覺結(jié)合蛋白的突變體只出現(xiàn)在昆蟲特定的一些組織中，這就可能與特異功能密切相關(guān)(Xuanetal., 2014)。在大草蛉ChrysopapallensCpalOBP4蛋白氨基酸定點突變實驗中，研究者也發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵氨基酸突變影響其對法尼醇等配基的結(jié)合力(Li TTetal., 2019)。第四，溫度變化影響嗅覺結(jié)合蛋白對配基結(jié)合力。體外結(jié)合實驗結(jié)果表明OBPs和CSPs與配基結(jié)合力受溫度變化影響(Wuetal., 2019a)。大部分昆蟲是變溫動物，體溫隨外界環(huán)境變化而改變，但體內(nèi)嗅覺結(jié)合蛋白與配基結(jié)合是否受影響還未見相關(guān)報道。

1.5 嗅覺結(jié)合蛋白作用機制

對于嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)運和釋放配基分子作用機制的研究比較欠缺，理論研究還不完善且存在一定的爭議。目前，嗅覺結(jié)合蛋白的作用機制主要有兩種假說：pH依賴的調(diào)控機制和配基分子誘導的構(gòu)象變化機制，其中pH依賴的嗅覺結(jié)合蛋白作用機制是主流觀點。上面我們提到，在不同pH下，嗅覺結(jié)合蛋白對配基的結(jié)合力不同，特別是低pH降低結(jié)合力，這就暗示pH能夠影響配基的結(jié)合和釋放(Pesentietal., 2008; Leal, 2013, Fuetal., 2018)。進一步研究推測，觸角淋巴液內(nèi)的pH可能不是均一的，而是pH值變化的環(huán)境，“嗅覺結(jié)合蛋白-配基”復(fù)合物在淋巴液中的運輸也受變化的pH調(diào)節(jié)，但在昆蟲觸角內(nèi)并未得到證實(Dambergeretal., 2013)。如果能夠通過理化技術(shù)證明觸角淋巴液內(nèi)pH是變化的，將有利于我們認知嗅覺結(jié)合蛋白的作用機制。另一種觀點認為配基分子誘導的蛋白構(gòu)象變化是嗅覺蛋白發(fā)揮作用的方式。我們知道，嗅覺結(jié)合蛋白對配基的結(jié)合具有廣譜性，主要是其內(nèi)部有一個疏水結(jié)合腔。反過來，氣味或信息素分子也可以調(diào)節(jié)嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)改變，這種構(gòu)象變化一方面使蛋白更好地與配基結(jié)合，另一方面，變化的嗅覺結(jié)合蛋白可以幫助配基靶向激活受體(Laughlinetal., 2008)。這種依賴嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)運的機制不僅適合多種氣味和信息素分子進入觸角，而且可以有效地防止它們被淋巴液中的氣味/信息素降解酶(odorant/pheromone degrading enzymes, ODEs/PDEs)所降解，對嗅覺系統(tǒng)十分重要。

但是，也有觀點認為部分疏水性外源分子到達受體過程中并不需要嗅覺結(jié)合蛋白的協(xié)助。在果蠅觸角中，敲除高豐度表達的OBPs基因后，其觸角上的不同感受器對外源氣味信號的反應(yīng)依然很強(Xiaoetal., 2019)。結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，在嗅覺感受器上分布著很多微孔小管(pore tubules)，每個感受器上平均約有83 000個，一些外源分子可以直接通過微孔小管擴散到達嗅覺受體，整個過程不需要嗅覺結(jié)合蛋白參與(Kaisslingetal., 1987; Larteretal., 2016)。不同感受器的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成不同，比如，黑腹果蠅錐形感器上就分布著很多微孔小管，但其毛形感器上卻沒有微孔小管，而是高表達OBP76a蛋白，說明同一物種的不同感受器之間嗅覺作用機制也存在差異(Shanbhagetal., 2000)。

2 嗅覺結(jié)合蛋白的表達與分布

早期對嗅覺結(jié)合蛋白的研究主要都集中在昆蟲的嗅覺感受器上，發(fā)現(xiàn)其在感受器淋巴液中高濃度表達(Klein, 1987)。在膜翅目、鱗翅目和雙翅目等昆蟲中最先發(fā)現(xiàn)的都是PBP，發(fā)現(xiàn)它們在雌雄蟲中差異或特異表達，能夠識別信息素類物質(zhì)，如膜翅目意大利蜜蜂ASP1(Briandetal., 2001)，鱗翅目黃地老虎AgrotissegetumPBP(LaForestetal., 1999)。在研究昆蟲寄生和取食等行為時在觸角中又發(fā)現(xiàn)了大量的GOBPs，與識別植物源氣味有關(guān)(Vogtetal., 1991)。后來，研究者發(fā)現(xiàn)OBPs在昆蟲觸角以外的組織中也有表達(李正西和Zhou, 2004; 李廣偉等, 2017)。隨著高通量測序和蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，加快了對嗅覺結(jié)合蛋白的研究(孟翔等, 2016)。在意大利蜜蜂中，總共存在21個OBPs，有13個在觸角中有表達，其中在觸角中特異表達的只有2個，其他的OBPs在腦、胸、卵巢和不同日齡幼蟲中均有表達(Foret and Maleszka, 2006)。我們知道，影響嗅覺結(jié)合蛋白功能的兩個因素是：表達豐度和結(jié)合能力，有些OBPs只在非嗅覺器官中表達，可能與特定功能有關(guān)，這將在蛋白功能部分詳細介紹。

相較于OBPs，CSPs的分布則更加廣泛，如在昆蟲頭部、跗節(jié)、下唇須、卵巢、腺體和表皮等都有表達。一方面是由于化學感受的感受器分布廣泛，在昆蟲體表毛發(fā)、跗節(jié)、口器和翅中均有化學感受器存在(張玉等, 2019)；另一方面是因為CSPs自身功能的多樣性。意大利蜜蜂基因組分析確定了6個CSPs，其中CSP5和CSP6在觸角中不表達，除了CSP5特異在蜂王卵巢和卵中表達外，其他CSPs在蜜蜂不同組織和發(fā)育不同階段廣泛表達(Foretetal., 2007)。家蠶中有22個CSPs，這些基因從卵到不同日齡幼蟲、以及成蟲腦、表皮、脂肪體、中腸和精/卵巢中都有分布，不同基因在時空上差異表達(Gongetal., 2007)。

目前，NPC2在昆蟲中的研究還比較少。昆蟲中，僅在膜翅目(意大利蜜蜂、中華蜜蜂Apisceranacerana、日本弓背蟻、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator)(Ishidaetal., 2014; Leeetal., 2014; Iovinellaetal., 2018; Zhengetal., 2018)、雙翅目(岡比亞按蚊、埃及伊蚊Aedesaegypti、黑腹果蠅、柑橘大果蠅Bactroceraminax)(Shietal., 2012; Caicedoetal., 2019; 陳劍等, 2020)、鱗翅目(棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、柞蠶Antheraeapernyi)(Zhuetal., 2018; Chenetal., 2020)、半翅目(黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis)(Wangetal., 2018)等4目11個種中發(fā)現(xiàn)了NPC2家族基因，數(shù)量也很少。這些基因功能研究很少，在昆蟲中的時空表達也還缺少研究。但是，綜合這些昆蟲物種的數(shù)據(jù)以及哺乳動物的數(shù)據(jù)，我們可以確定NPC2基因在昆蟲嗅覺器官和非嗅覺器官中都有表達，功能也各不相同。

3 嗅覺結(jié)合蛋白的功能

經(jīng)過40年的研究，昆蟲中嗅覺結(jié)合蛋白家族成員不斷擴大。由于其相對簡單而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使其能適應(yīng)各種環(huán)境和任務(wù)，所以這些蛋白的功能復(fù)雜多樣，且這些功能對昆蟲生理和行為尤為重要。

3.1 識別轉(zhuǎn)運外源氣味和信息素分子

作為嗅覺結(jié)合蛋白，最初研究它們的功能就是在嗅覺系統(tǒng)中結(jié)合轉(zhuǎn)運氣味和信息素分子。OBPs, CSPs和NPC2均為球狀結(jié)構(gòu)，親水性氨基酸分布于蛋白表面，使它們具有強水溶性，疏水性氨基酸在內(nèi)部形成空腔，用于結(jié)合配基(Lartigueetal., 2002; Zhou, 2010)。疏水性的氣味分子或信息素分子無法穿過淋巴液，所以在嗅覺結(jié)合蛋白的協(xié)助下到達嗅覺受體(Leal, 2013)。在意大利蜜蜂中，ASP1可以轉(zhuǎn)運蜂王信息素HOB到達嗅覺受體(odor receptors, ORs)OR11(Briandetal., 2001; Wanneretal., 2007)。但是，嗅覺結(jié)合蛋白并不是簡單地被動轉(zhuǎn)運，它們可以識別不同的氣味或信息素分子。研究發(fā)現(xiàn)，OBPs, CSPs和NPC2對配基結(jié)合雖然都有廣譜性，但與不同分子的結(jié)合力不同(Wuetal., 2019a)。比如，意大利蜜蜂中大多數(shù)OBPs和CSPs都能和幼蟲信息素β-羅勒烯和別羅勒烯結(jié)合，其中CSP4與兩者結(jié)合力最強，且CSP4高表達的個體對幼蟲識別能力更強，有利于幼蟲識別和蜂王漿高產(chǎn)(Wuetal., 2019b)。所以，嗅覺結(jié)合蛋白可以特異識別和轉(zhuǎn)運氣味和信息素分子。

3.2 協(xié)助激活受體

嗅覺結(jié)合蛋白可以協(xié)助氣味分子激活昆蟲嗅覺受體。研究表明，昆蟲嗅覺受體是一種配體門控離子通道，配基與受體結(jié)合后激活信號通路(Satoetal., 2008; Leal, 2013)。大多數(shù)配基都是直接激活嗅覺受體，但部分受體激活則需要嗅覺結(jié)合蛋白的參與，即形成“嗅覺結(jié)合蛋白-氣味復(fù)合物”發(fā)揮作用(Leal, 2013)。LUSH(DmelOBP76a)是黑腹果蠅中第一個功能明確的氣味結(jié)合蛋白，對信息素識別十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，LUSH缺失型個體對信息素Z11-18OAc沒有反應(yīng)，只有LUSH存在時才能引起神經(jīng)刺激，說明LUSH能夠協(xié)助Z11-18OAc激活受體(Xuetal., 2005)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅雄性信息素成分順式-Vaccenyl acetate也是通過與LUSH形成復(fù)合物來激活受體的(Laughlinetal., 2008)。目前，LUSH是唯一報道可以協(xié)助激活受體的氣味結(jié)合蛋白，在其他昆蟲中還未見需要氣味結(jié)合蛋白協(xié)助來激活受體的報道。

3.3 緩沖作用

嗅覺結(jié)合蛋白依靠結(jié)合能力緩沖局部環(huán)境中某些分子的快速變化。在昆蟲中，一些嗅覺結(jié)合蛋白在嗅覺器官中高豐度表達，但并沒有轉(zhuǎn)運外源分子的作用(Pelosietal., 2018a)。黑腹果蠅觸角錐形感受器中OBP28a是唯一高豐度表達的氣味結(jié)合蛋白，敲除后并不影響其嗅覺反應(yīng)，而是在觸角起到緩沖作用，即“增益控制”作用(Larteretal., 2016)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，OBP28a在觸角中緩沖的主要對象是β-紫羅蘭酮等多種植物源氣味分子，以防止這些物質(zhì)的反復(fù)刺激(Gonzalezetal., 2020)。增益控制對于昆蟲的任何感受系統(tǒng)都是必不可少的，比如昆蟲對溫度變化的調(diào)節(jié)以及昆蟲腦中信號通路的調(diào)節(jié)(Tichyetal., 2008; Serranoetal., 2013)。在嗅覺系統(tǒng)下游，嗅覺受體神經(jīng)元也是通過增益控制來調(diào)節(jié)神經(jīng)活動，以防止神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)興奮并提高嗅覺編碼的靈敏度(Gorur-Shandilyaetal., 2017; Kadakia and Emonet, 2019)。緩沖作用對昆蟲生理具有重要意義。

3.4 轉(zhuǎn)運和釋放內(nèi)源信息素

昆蟲體內(nèi)分布很多腺體，部分嗅覺相關(guān)蛋白在昆蟲腺體中高表達或特異表達，可以協(xié)助腺體中的信息素釋放。我們知道，昆蟲信息素極其豐富，在種間和種內(nèi)的化學通訊中起到重要作用(Slessoretal., 2005)。在蜜蜂中，蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示有9個OBPs和2個CSPs在下頜腺有分布(Danietal., 2010; Iovinellaetal., 2011)。對家蠶研究發(fā)現(xiàn)，7個CSPs在雌蟲性信息素腺體中表達(Danietal., 2011)。序列分析發(fā)現(xiàn)，信息素腺體中CSPs還存在大量突變體，能讓它們結(jié)合更多的配基(Xuanetal., 2014)。對黑腹果蠅雄蟲的精液研究發(fā)現(xiàn)，其中存在6種OBPs，可以結(jié)合雄性信息素成分順式-vaccenyl acetate (Dyanov and Dzitoeva, 1995; Takemori and Yamamoto, 2009)。在棉鈴蟲雄蟲精液中富含高豐度的OBP10，其在交配過程中會由雄蟲轉(zhuǎn)移到雌蟲體內(nèi)，最終會留在受精卵表面(Sunetal., 2012)。東亞飛蝗Locustamigratoria雄蟲生殖器中含有很多CSPs蛋白，其中一個高豐度的LmigCSP91可以較好地結(jié)合α-萘基丙腈和β-萘基丙腈(Banetal., 2013; Zhouetal., 2013)。除了性腺和生殖腺外，膜翅目昆蟲的毒液腺中也發(fā)現(xiàn)了OBPs和CSPs。比如，在寄生蜂Leptopilinaheterotoma和Pteromaluspuparum的毒腺中都發(fā)現(xiàn)OBPs和CSPs的存在，可能與毒液分泌有關(guān)(Heavneretal., 2013; Wangetal., 2015)。蛋白質(zhì)組分析顯示意大利蜜蜂毒腺中存在OBP21，但尚不清楚其功能(Lietal., 2013)。在甘藍夜蛾、小地老虎Agrotisipsilon和埃及伊蚊等的腺體中也發(fā)現(xiàn)了OBPs和CSPs(Pelosietal., 2014a)。所以，嗅覺結(jié)合蛋白在信息素合成和分泌過程中發(fā)揮作用。

3.5 發(fā)育、修復(fù)和組織再生

OBPs和CSPs參與到昆蟲個體發(fā)育，甚至是組織再生。最早研究嗅覺結(jié)合蛋白與發(fā)育相關(guān)的是美洲大蠊Periplanetaamericana，發(fā)現(xiàn)在其足的再生過程中，PameP10的表達量顯著上調(diào)(Nomuraetal., 1992; Kitabayashietal., 1998)。在意大利蜜蜂中，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示CSP5在卵巢和卵中特異表達，與胚胎的正常發(fā)育密切相關(guān)(Foretetal., 2007; Maleszkaetal., 2007)。在紅火蟻Solenopsisinvicta中，其Si-CSP9在3日齡幼蟲中高表達，通過影響脂肪酸的生物合成以及其他代謝通路調(diào)節(jié)角質(zhì)層的發(fā)育和蛻皮(Chengetal., 2015)。在埃及伊蚊中，AaegOBP1, AaegOBP11, AaegOBP13, AaegOBP44和AaegOBP45可能與卵膜的形成有關(guān)，但具體的調(diào)控機制尚不清楚(Amenyaetal., 2010; Costa-da-Silvaetal., 2013)。在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中，SexiCSP3在雌蟲生殖器中表達量高于雄蟲，RNAi干擾后會抑制其產(chǎn)卵能力，而且卵的孵化率顯著降低，說明其參與卵的形成和發(fā)育(Gongetal., 2012)。對沙漠飛蝗散居和群居個體的比較中，發(fā)現(xiàn)兩者生理和行為方面有很大的差異，但卻可以相互轉(zhuǎn)化，這個轉(zhuǎn)化過程與CSPs的表達變化密切相關(guān)(Guoetal., 2011)。

3.6 抗炎免疫活性

嗅覺結(jié)合蛋白的抗炎免疫作用是研究者在吸血類昆蟲中發(fā)現(xiàn)的。蚊蟲叮咬后，宿主自身的免疫反應(yīng)會使血液凝集以防止吸血，研究發(fā)現(xiàn)斯氏按蚊Anophelesstephensi唾液中的一些OBPs起到血液抗凝劑的作用，防止進食中斷(Isawaetal., 2002)。蚊蟲取食過程中，宿主會分泌去甲腎上腺素和5-羥色胺等生物胺類物質(zhì)，可引起腫脹、紅斑和瘙癢等癥狀，在岡比亞按蚊和埃及伊蚊的唾液中含有一些OBPs，它們對這些生物胺有很強的親和力，通過抑制宿主炎癥反應(yīng)可以使取食順利進行(Mansetal., 2007; Calvoetal., 2009)。對黑腹果蠅研究發(fā)現(xiàn)，過表達的NPC2a和NPC2e可以通過雙翅殺菌肽啟動子來激活其先天免疫(Shietal., 2012)。此外，埃及伊蚊和白蛉Phlebotomusargentipes中一些D7相關(guān)蛋白和OBPs有相似結(jié)構(gòu)，具有免疫原性(Martín-Martínetal., 2013; Oktariantietal., 2015)。對中華蜜蜂NPC2功能分析時，發(fā)現(xiàn)細菌和真菌感染初期AcNPC2a在激發(fā)先天免疫方面也發(fā)揮重要作用(Leeetal., 2014)。在埃及伊蚊中，NPC2對其降低登革熱病毒感染方面效果顯著(Caicedoetal., 2019)。這些作用的信號通路和調(diào)控過程還不清楚，相關(guān)功能和調(diào)節(jié)機制需要進一步研究。

3.7 耐藥性作用

昆蟲防治面臨的主要問題之一就是耐藥性，而耐藥性的產(chǎn)生一個原因可能與嗅覺結(jié)合蛋白有關(guān)。用阿維菌素處理家蠶時，它們體內(nèi)20個CSPs在不同組織中增強表達，部分蛋白對阿維菌素還有較好的親和力(Xuanetal., 2015)。用亞致死劑量的新煙堿類殺蟲劑防治煙粉虱Bemisiatabaci時，其BtabCSP1在腹部表達量升高(Liu GXetal., 2014)。對于小菜蛾P(guān)lutellaxylostella，用汴氯菊酯處理后其體內(nèi)OBP13, CSP4和CSP8表達量增高(Bautistaetal., 2015)。這些蛋白一方面直接結(jié)合農(nóng)藥分子起到抗藥性作用，另一方面可能激活下游信號通路調(diào)節(jié)耐藥性產(chǎn)生。目前，研究者只是發(fā)現(xiàn)殺蟲劑處理后嗅覺結(jié)合蛋白表達量增加，但是這些蛋白調(diào)控耐藥性的機制尚不清楚(Pelosietal., 2018a)。

3.8 味覺和營養(yǎng)功能

昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白在味覺器官中高表達，可能參與攝食和營養(yǎng)吸收等功能(Sanchez-Graciaetal., 2009)。首先，昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白可以幫助昆蟲攝取疏水性物質(zhì)。對綠頭蠅Phormiaregina研究發(fā)現(xiàn)，它們喜食富含脂肪酸的腐肉，但這些脂肪酸不溶于水，而其味覺中的PregOBP57a可能通過pH變化來攝取脂肪酸類物質(zhì)(Ishidaetal., 2013)。在棉鈴蟲中，HarmCSP4在口器中高表達，能夠結(jié)合疏水性成分β-胡羅卜素來攝取營養(yǎng)(Zhuetal., 2016)。其次，昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白可以協(xié)助取食過程。在一些飛蛾和蝴蝶中，發(fā)現(xiàn)它們口器中CSPs含量很高。比如，甘藍夜蛾的口器中CSPs大量表達，它們在取食過程中調(diào)節(jié)宿主的生理狀況，以便甘藍夜蛾取食(Nagnan-Le Meillouretal., 2000)。在棉鈴蟲和煙青蟲Helicoverpaassulta成蟲喙中，CSP4大量表達，在其吸吮葉汁時分泌CSP4來降低靜水壓保證攝食過程順利進行(Liu YLetal., 2014)。最后，嗅覺結(jié)合蛋白對一些重要的營養(yǎng)物質(zhì)具有高親和力。對于黑腹果蠅來說，L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺是必需氨基酸，其體內(nèi)分布的OBP19b對這些物質(zhì)具有高親和力，有利于快速結(jié)合和轉(zhuǎn)運這兩種氨基酸(Rihanietal., 2019)。對一些吸血類昆蟲的研究發(fā)現(xiàn)，它們嗜血行為可能與CSPs基因家族進化有關(guān)，影響了它們的取食習慣(Freitas and Nery, 2020)。

4 嗅覺結(jié)合蛋白的應(yīng)用

4.1 生物防治與物種保護

眾所周知，嗅覺系統(tǒng)在昆蟲覓食、尋偶交配和尋找寄主等方面都發(fā)揮著重要作用(Leal, 2013)。昆蟲種類繁多，但大部分都是農(nóng)林害蟲。因此，我們可以通過嗅覺系統(tǒng)的特性利用反向化學生態(tài)學的方法研究生物防治的策略。

基于昆蟲嗅覺設(shè)計的生物防治有誘殺和毒殺兩種方式。誘殺是利用昆蟲信息素來進行引誘防治(Brandetal., 1979)。褐翅椿象Plautiastali是一種為害水果和蔬菜的農(nóng)業(yè)害蟲，研究者根據(jù)其聚集信息素成分合成的物質(zhì)methyl (E,E,Z)-2,4,6-decatrienoate可以高效引誘雌雄蟲，進而設(shè)計陷阱捕殺(Jangetal., 2011)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的主要性信息素成分為(4aS,7S,7aR)-nepetalactone和(1R,4aS,7S,7aR)-nepetalactol，它們對豌豆蚜有顯著的引誘作用，可以通過合成其性信息素或類似物來進行誘殺(Nakashimaetal., 2016)。毒殺是通過一些物質(zhì)抑制或阻斷昆蟲嗅覺系統(tǒng)信號傳遞，即可以根據(jù)昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白的結(jié)合特性設(shè)計與其結(jié)合力強的殺蟲劑分子(Pelosietal., 2018a)。二點委夜蛾Athetislepigone體內(nèi)有兩個氣味結(jié)合蛋白AlepOBP1和AlepOBP2，AlepOBP1對殺蟲劑毒死蜱和肟硫磷有強結(jié)合力，AlepOBP2與性信息素(Z)-7-dodecenyl acetate和(Z)-9-tetradecenyl acetate結(jié)合，可以人工合成同時具有AlepOBP1和AlepOBP2蛋白結(jié)構(gòu)的分子對其進行防治(Zhangetal., 2020)。(E)-β-法尼烯是豌豆蚜重要的報警信息素，可以用于防治豌豆蚜，但由于其易揮發(fā)和氧化，所以難以推廣和應(yīng)用。研究者根據(jù)(E)-β-法尼烯的結(jié)構(gòu)合成其類似物，同時在其上加上殺蟲劑的吡唑結(jié)構(gòu)，使其具有高效的殺蟲效果(Sunetal., 2011)。

值得注意的是，在生物防治的過程中，我們要形成保護益蟲的意識。對中華蜜蜂嗅覺研究發(fā)現(xiàn)，新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉能夠影響ASP2對氣味分子的識別能力，可能導致嗅覺反應(yīng)遲鈍(Lietal., 2015)，類似的情況在中華蜜蜂CSP1(Lietal., 2017a)和茶尺蠖EctropisobliquaGOBP2蛋白中也有發(fā)現(xiàn)(Lietal., 2017b)。所以，農(nóng)藥對嗅覺結(jié)合蛋白的影響具有兩面性：即可毒殺害蟲也可能損害益蟲的嗅覺感受系統(tǒng)。研究者在設(shè)計農(nóng)藥時不僅要考慮防治害蟲，還要考慮不要對益蟲產(chǎn)生影響，以提高殺蟲劑的特異性。

4.2 用于品種選育的分子標記

利用分子標記輔助育種在動植品種選育方面都有應(yīng)用，嗅覺結(jié)合蛋白也是一種重要的標記物。對意大利蜜蜂研究發(fā)現(xiàn)，其工蜂通過觸角中CSP4識別幼蟲信息素β-羅勒烯和別羅勒烯來哺育幼蟲，如果通過選育CSP4蛋白高表達的蜜蜂品系則有利于幫助培育出蜂王漿高產(chǎn)的蜜蜂(Wuetal., 2019b)。在選育的意大利蜜蜂中，發(fā)現(xiàn)清理行為強的蜜蜂觸角中OBP17和OBP18高表達，它們可能通過這兩個蛋白識別病原微生物來減少蜂群的致病率(Huetal., 2016)。這種通過嗅覺結(jié)合蛋白選育的蜜蜂在高產(chǎn)和抗病方面發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上，研究者通過利用分子建模、分子對接和系統(tǒng)發(fā)育等方法，建立了一種快速分析蜜蜂氣味結(jié)合蛋白與氣味分子的配對模式，如OBP16-N-phenyl-2-napthalamine、OBP1-可卡因、OBP10-美沙酮、OBP2-大麻之間有較好親和力，這不僅給選育提供了新的方向而且加快了選育過程，可以通過選育和訓練使蜜蜂能夠識別毒品和炸藥類物質(zhì)，進而在實踐中得以應(yīng)用(Langeswaranetal., 2018)。目前，基于嗅覺結(jié)合蛋白選育新的品系只在益蟲(蜜蜂、家蠶等)中有研究，在害蟲中還未見報道。

4.3 制作生物傳感器

自嗅覺結(jié)合蛋白發(fā)現(xiàn)后，研究者一直希望通過它們的特異性和靈敏性設(shè)計高效的生物傳感器。通過細菌表達昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白，再利用理化方法偶聯(lián)在感應(yīng)裝置上來檢測特定物質(zhì)，檢測能力都在微摩爾范圍內(nèi)(Pelosietal., 2014b)。作為模式生物，對蜜蜂嗅覺蛋白的配基結(jié)合譜的研究較多，其中OBP2(ASP2)和OBP14已經(jīng)被制作成生物傳感器用來檢測環(huán)境中氣味分子的變化(Luetal., 2014; Larisikaetal., 2015)。在黑腹果蠅中，LUSH對醇類物質(zhì)有很好的識別能力，利用其設(shè)計的生物傳感器已經(jīng)用來檢測火腿和牛肉中沙門氏菌的含量(Sankaranetal., 2011; Sonetal., 2016)。利用岡比亞按蚊AgamOBP1重組表達蛋白設(shè)計的傳感器，可以用來測試大腸菌群特征代謝物吲哚的存在，進而分析飲用水污染情況(Dimitratosetal., 2019)。此外，AgamOBP1的突變體與大麻、搖頭丸和可卡因等毒品成分有很高親和力(Khasim and Krishna, 2020)，這在功能上與蜜蜂的氣味結(jié)合蛋白有相似之處(Langeswaranetal., 2018)，也是作為開發(fā)新型生物嗅覺檢測器的潛在蛋白。這些結(jié)果都充分說明利用嗅覺結(jié)合蛋白設(shè)計生物傳感器的可行性與巨大的應(yīng)用價值。

但是，由于對嗅覺編碼認知的局限性以及缺乏有效的嗅覺感應(yīng)元件，所以嗅覺傳感器一直沒有得到廣泛應(yīng)用。第一，嗅覺編碼十分復(fù)雜，我們對嗅覺蛋白的配基結(jié)合譜的研究還不足。對已經(jīng)研究的嗅覺結(jié)合蛋白分析發(fā)現(xiàn)，一個蛋白可以識別和結(jié)合多種配基，而一個配基也可以被多種蛋白結(jié)合，這就導致檢測準確性降低 (Li FQetal., 2019; Wuetal., 2019a)。如果要利用這些蛋白制作傳感器，就需要找到它們特異且高親和的配基分子。第二，需要開發(fā)有效的嗅覺感應(yīng)元件。目前，在傳感器中使用的感應(yīng)方法包括電化學阻抗法等，雖然檢測能力達到微摩爾水平，但與昆蟲的識別能力還有很大的差距(Luetal., 2014; Pelosietal., 2018b)。最近，研究者利用硅納米線(silicon nanowire, SiNW)制作的生物傳感器的檢測限已經(jīng)達到十億分之一，在檢測能力上有了很大進步，可能具有廣泛的應(yīng)用前景(Gao, 2020)。此外，很多感應(yīng)元件還存在攜帶不便、使用麻煩和制作困難等缺點，特別是實驗室之外使用難度大，這就造成嗅覺結(jié)合蛋白在傳感應(yīng)用方面的局限性。因此，科研工作者在未來研究中需要探索更高效的生物傳感裝置。

5 結(jié)語

昆蟲嗅覺系統(tǒng)極其靈敏，這與其嗅覺結(jié)合蛋白密切相關(guān)。在昆蟲中鑒定的嗅覺結(jié)合蛋白已經(jīng)超過600個，它們結(jié)構(gòu)復(fù)雜且在昆蟲體內(nèi)分布范圍廣泛，功能多樣，具有巨大的潛在應(yīng)用價值。但是，相關(guān)的研究還遠遠不足，未來對嗅覺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及發(fā)揮作用的機制應(yīng)該是研究的重點。如果深入研究，那么基于昆蟲嗅覺結(jié)合蛋白的生物防治、資源選育和生物嗅覺傳感器等都具有廣泛的應(yīng)用前景。