王 露, 魏博帆, 李苗苗, 李曉哲, 王 博, 闞云超, 喬惠麗

(南陽(yáng)師范學(xué)院, 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南南陽(yáng) 473061)

后生動(dòng)物的腸道通常有多種細(xì)菌和其他微生物，腸道微生物可通過(guò)宿主與微生物的互作、不同微生物之間的互作產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而影響宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝(Newell and Douglas, 2014; Wongetal., 2014; Leit?o-Gon?alvesetal., 2017)、發(fā)育(Shinetal., 2011; Storellietal., 2011; Ridleyetal., 2012; Tefit and Leulier, 2017; Qiaoetal., 2019)、壽命(Guoetal., 2014; Clarketal., 2015; Leeetal., 2019)、免疫(Sansoneetal., 2015)和疾病(vanetal., 2013; Zhangetal., 2015)等許多生理和病理過(guò)程。腸道微生物與宿主間的互作已成為近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

黑腹果蠅Drosophilamelanogaster作為一種重要的模式生物，被廣泛用于宿主與腸道微生物的互作研究。在自然條件下，果蠅中的大部分種類以腐爛的水果或植物為食，廣泛存在于人類的棲息地內(nèi)，可能干擾人類的正常工作和生活，也可能成為食物的污染源，部分果蠅種類還能帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Harrington and Axtell, 1994; Benton, 2010)。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅可通過(guò)識(shí)別酵母和腐爛水果的揮發(fā)性氣味分子來(lái)定位食源和產(chǎn)卵地點(diǎn)(St?kletal., 2010; Becheretal., 2012; Keeseyetal., 2015)。此外，果蠅的寄生環(huán)境中往往會(huì)存在有害的真菌和細(xì)菌，果蠅腸道微生物可產(chǎn)生抑制有害真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)(Mauchetal., 2010; Crowleyetal., 2012)。通過(guò)對(duì)果蠅腸道微生物多樣性的研究，發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅腸道微生物的組成相對(duì)比較簡(jiǎn)單，其種類主要為醋酸桿菌屬Acetobacter和乳酸桿菌屬Lactobacillus，此外還包含一些酵母菌和其他微生物(Chandleretal., 2011; Wongetal., 2011; Broderick and Lemaitre, 2012; Staubachetal., 2013; Wongetal., 2017)。研究表明，果蠅幼蟲和成蟲生存環(huán)境中的微生物不僅可影響果蠅的腸道微生物組(Chandleretal., 2011)，還可影響果蠅的覓食、發(fā)育、交配和產(chǎn)卵等行為(Keeseyetal., 2017; Leit?o-Gon?alvesetal., 2017; Tefit and Leulier, 2017; Wongetal., 2017)。果蠅的幼蟲和成蟲對(duì)經(jīng)幼蟲取食過(guò)食物的偏好大于對(duì)未經(jīng)取食過(guò)或無(wú)菌果蠅取食過(guò)的無(wú)菌食物(Durisko and Dukas, 2013; Duriskoetal., 2014)，幼蟲腸道細(xì)菌所產(chǎn)生的氣味分子在此過(guò)程中發(fā)揮作用(Venuetal., 2014)。

在黑腹果蠅中，腸道微生物對(duì)發(fā)育的調(diào)控主要通過(guò)胰島素信號(hào)通路，胰島素樣受體基因(insulin-like receptor gene,InR)的轉(zhuǎn)錄通過(guò)FoxO轉(zhuǎn)錄因子的活性直接負(fù)調(diào)控胰島素信號(hào)通路，因此，InR的表達(dá)可作為果蠅胰島素樣肽(insulin-like peptides, dILPs)系統(tǒng)活性的負(fù)調(diào)控分子標(biāo)記(Puig and Tjian, 2005)。InR作為該信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控基因，其表達(dá)量越低，該信號(hào)通路活性越高，果蠅的發(fā)育越快(Storellietal., 2011)。目前關(guān)于腸道微生物影響黑腹果蠅行為和發(fā)育的研究已有較多報(bào)道，但腸道微生物種類較多，不同的微生物具有不同的生物學(xué)特性，從而使其對(duì)宿主的影響和調(diào)控機(jī)制各不相同。此外，腸道微生物之間、腸道微生物與寄生環(huán)境中微生物之間的互作是否影響果蠅的行為，目前還不清楚。

本研究選取2種代表性的果蠅腸道微生物植物乳桿菌Lactobacillusplantarum和蘋果醋酸桿菌Acetobactermalorum及環(huán)境中影響果蠅覓食的關(guān)鍵微生物釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，采用引誘實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)交配前后黑腹果蠅的覓食和產(chǎn)卵行為的影響，檢測(cè)不同微生物的混合物對(duì)黑腹果蠅行為調(diào)控的變化，檢測(cè)這3種微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究腸道微生物與果蠅的互作和調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系和飼養(yǎng)

本研究選用黑腹果蠅品系Canton S，在培養(yǎng)箱溫度25±2℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期12L∶12D的條件下飼養(yǎng)(常州海博SX-500)。黑腹果蠅飼養(yǎng)培養(yǎng)基的配方(1 000 mL): 22 g啤酒酵母粉，95 g玉米粉，118 g紅糖，4.2 g瓊脂粉(Solarbio)，2.4 mL丙酸(天津化工)，3.3 mL對(duì)羥基甲酸甲酯(30%)(天津化工)。收集黑腹果蠅卵的葡萄汁固體培養(yǎng)基的配方: 100 mL葡萄汁，1 mL乙酸(天津化工)，1 mL乙醇(天津化工)，1 g瓊脂糖(Solarbio)。收集黑腹果蠅卵時(shí)在平板上添加少量的酵母膏(Qiaoetal., 2019)。

1.2 供試菌株體外培養(yǎng)及接種

實(shí)驗(yàn)供試菌株購(gòu)自德國(guó)DSMZ微生物保藏中心的植物乳桿菌(20174-0916-001)、蘋果醋酸桿菌(14337-0313-001)和釀酒酵母(1333-0317-001)。植物乳桿菌和蘋果醋酸桿菌用MRS肉湯培養(yǎng)基，釀酒酵母用YPD培養(yǎng)基(Solarbio)于30℃ 200 r/min搖床恒溫培養(yǎng)(上海智誠(chéng)ZWY-240)，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂(Solarbio)。3種不同微生物分別于30℃搖床培養(yǎng)24 h，新鮮菌液用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Eppendorf)在600 nm處測(cè)OD值，然后分別取1 mL OD600=1的上述3種菌液，用PBS進(jìn)行洗滌后重懸于100 μL的PBS，接種于不含對(duì)羥基甲酸甲酯的中號(hào)果蠅培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中，使每個(gè)菌液樣品鋪滿果蠅培養(yǎng)基表面。對(duì)照為不添加任何微生物的正常培養(yǎng)基。

1.3 黑腹果蠅成蟲引誘實(shí)驗(yàn)

未交配的雌、雄果蠅成蟲主要行為是覓食和交配，非處女蠅則為覓食和產(chǎn)卵。為了明確不同微生物在黑腹果蠅尋找食源和產(chǎn)卵地點(diǎn)中的作用，我們首先采用引誘實(shí)驗(yàn)檢測(cè)交配前后雌、雄黑腹果蠅成蟲對(duì)3種微生物的趨性。

1.3.1單一微生物對(duì)交配前后雌雄黑腹果蠅的引誘力檢測(cè)：黑腹果蠅成蟲引誘實(shí)驗(yàn)在一個(gè)高度為10 cm，上下直徑分別為15.5 cm和14 cm的圓柱形塑料透明容器中進(jìn)行，頂部蓋子上有透氣孔，內(nèi)部倒置兩個(gè)高4.5 cm，直徑3 cm的塑料小瓶，瓶底插入一個(gè)頂端開口直徑為2 mm的塑料槍頭，瓶蓋內(nèi)部各放一個(gè)直徑為5 mm的濾紙片，先加30 μL濃度為80%的甘油，再分別添加用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基清洗濃縮至50 μL的菌液(取1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基清洗濃縮至50 μL)或等體積的正常培養(yǎng)基(對(duì)照)。每組實(shí)驗(yàn)中，25頭4-5日齡的未交配或交配后的雌、雄黑腹果蠅，經(jīng)饑餓處理24 h后被轉(zhuǎn)移到上述引誘裝置中，24 h后對(duì)每個(gè)塑料小瓶?jī)?nèi)外的果蠅數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。引誘指數(shù)(attraction index,AI)的計(jì)算公式為:AI=(O-C)/T，其中，O是添加菌液的塑料小瓶中的果蠅數(shù)量，C是添加正常培養(yǎng)基的塑料小瓶中的果蠅數(shù)量，T是測(cè)試果蠅的總數(shù)。引誘指數(shù)從-1(完全回避)到1(完全吸引)，引誘系數(shù)為零表示中性。所有實(shí)驗(yàn)條件與黑腹果蠅飼養(yǎng)條件相同，每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。

1.3.2兩種不同微生物對(duì)黑腹果蠅非處女蠅的引誘力檢測(cè)：在黑腹果蠅的自然取食環(huán)境中，微生物的種類多種多樣，為檢測(cè)在不同微生物存在的情況下對(duì)黑腹果蠅行為的影響，在1.3.1節(jié)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)3種微生物都具有明顯趨向性的雌性非處女蠅，進(jìn)一步檢測(cè)其在兩種不同微生物之間的趨向性。

同1.3.1節(jié)中的方法，用植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母的兩兩組合對(duì)黑腹果蠅進(jìn)行引誘實(shí)驗(yàn)。 取1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液清洗濃縮為50 μL，不同組合的菌液分別被添加到引誘裝置中兩個(gè)不同塑料小瓶?jī)?nèi)的濾紙片上，25頭4-5日齡非處女蠅經(jīng)饑餓處理24 h后被轉(zhuǎn)移到1.3.1節(jié)中的引誘裝置中，24 h后對(duì)每個(gè)塑料小瓶?jī)?nèi)外的果蠅數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算引誘系數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。

1.3.3單一微生物和不同微生物混合物對(duì)黑腹果蠅非處女蠅的引誘力檢測(cè)：同1.3.1節(jié)中的方法，用植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母分別與這3種微生物的2種或3種的混合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性引誘實(shí)驗(yàn)。單一微生物為取1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液清洗濃縮為60 μL，2種不同微生物的混合物為取1.2節(jié)OD600=1的2種菌液各1 mL分別清洗濃縮為30 μL，2種菌的總體積仍為60 μL，3種不同微生物的混合物為取1.2節(jié)OD600=1的3種菌液各1 mL分別清洗濃縮為20 μL，3種菌的總體積仍為60 μL。同上，25頭4-5日齡的非處女蠅經(jīng)饑餓處理24 h后被轉(zhuǎn)移到1.3.1節(jié)中的引誘裝置中，24 h后對(duì)每個(gè)塑料小瓶?jī)?nèi)外的果蠅數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算引誘系數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。

1.4 黑腹果蠅產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)

基于上述結(jié)果，為進(jìn)一步探究3種微生物對(duì)黑腹果蠅產(chǎn)卵選擇的影響，我們采用產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)雌性非處女蠅對(duì)植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母的單一微生物、兩種不同微生物、單一微生物與不同微生物混合物之間的產(chǎn)卵選擇偏好。

1.4.1黑腹果蠅對(duì)單一微生物的產(chǎn)卵偏好性檢測(cè)：黑腹果蠅產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)采用一個(gè)高度為9 cm，上下直徑分別為12 cm和10 cm的圓柱形塑料透明容器中進(jìn)行，頂部蓋子上有透氣孔，內(nèi)部放置一個(gè)直徑為90 mm的瓊脂糖固體平板，平板對(duì)應(yīng)兩側(cè)各放一個(gè)直徑為5 mm的濾紙片，先加30 μL濃度為80%的甘油，然后再分別添加50 μL的菌液(1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液)或等體積的正常培養(yǎng)基。30頭4-5日齡雌性果蠅被轉(zhuǎn)移到上述產(chǎn)卵裝置中，24 h后統(tǒng)計(jì)平板中間線兩側(cè)卵的數(shù)目，并計(jì)算產(chǎn)卵指數(shù)(oviposition index,OI)。產(chǎn)卵指數(shù)OI的計(jì)算公式為:OI=(O-C)/(O+C)，其中，O為平板上添加微生物一側(cè)卵的數(shù)量，C為添加正常培養(yǎng)基一側(cè)的卵的數(shù)量。每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。

1.4.2黑腹果蠅在兩種不同微生物間的產(chǎn)卵偏好性檢測(cè)：同1.4.1節(jié)中的方法，用植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母的兩兩組合檢測(cè)黑腹果蠅的產(chǎn)卵趨性。分別在產(chǎn)卵裝置中的瓊脂糖平板的兩側(cè)的濾紙片上各添加50 μL處理后的不同菌液(1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液)，然后放入30頭4-5日齡雌性果蠅，24 h后統(tǒng)計(jì)平板中間線兩側(cè)卵的數(shù)目，并計(jì)算產(chǎn)卵指數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)采用5個(gè)重復(fù)。

1.4.3黑腹果蠅在單一微生物與不同微生物混合物間的產(chǎn)卵偏好性檢測(cè)：同1.4.1節(jié)中的方法，檢測(cè)果蠅對(duì)植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母這3種微生物中的兩種或3種的混合物的產(chǎn)卵選擇。單一微生物為取1.2節(jié)1 mL OD600=1的新鮮菌液清洗濃縮為60 μL，兩種不同微生物的混合物為取1.2節(jié)OD600=1的兩種菌液各1 mL分別清洗濃縮為30 μL，兩種菌的總體積仍為60 μL，3種不同微生物的混合物為取1.2節(jié)OD600=1的3種菌液各1 mL分別清洗濃縮為20 μL，3種菌的總體積仍為60 μL。產(chǎn)卵裝置中放入30頭4-5日齡的雌性果蠅，24 h后統(tǒng)計(jì)平板中間線兩側(cè)卵的數(shù)目，并計(jì)算產(chǎn)卵指數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)。

1.5 含不同微生物的培養(yǎng)基上黑腹果蠅幼蟲發(fā)育觀測(cè)

為了研究黑腹果蠅的產(chǎn)卵選擇偏好是否與其幼蟲的發(fā)育相關(guān)，我們進(jìn)一步檢測(cè)黑腹果蠅幼蟲在接種有植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的活菌或滅活菌的培養(yǎng)基中的發(fā)育和化蛹情況。首先收集黑腹果蠅產(chǎn)下4 h內(nèi)的卵，一部分分別轉(zhuǎn)移到1.2節(jié)制備的接種有100 μL植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基(對(duì)照)中，每瓶放入50粒卵，正常條件下培養(yǎng)72 h后對(duì)不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的幼蟲進(jìn)行稱重，并在體視顯微鏡下拍照(Nikon SMZ-1500)。每組稱重幼蟲為10組生物學(xué)重復(fù)。

另一部分果蠅卵放入分別接種有植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母(活菌或滅活菌)培養(yǎng)基及正常培養(yǎng)基中，每瓶50粒卵。 3種微生物的活菌分別為取1.2節(jié)每1 mL OD600=1的菌液分別清洗濃縮為100 μL；3種微生物的滅活菌分別為取1.2節(jié)每3 mL OD600=1的菌液清洗濃縮為100 μL，并高壓滅菌。果蠅卵移入之日記為0 d，每天8∶00和20∶00統(tǒng)計(jì)化蛹數(shù)，至全部化蛹。每組實(shí)驗(yàn)10個(gè)重復(fù)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)黑腹果蠅幼蟲體內(nèi)InR的表達(dá)水平

為了進(jìn)一步探索微生物影響黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的分子機(jī)制，利用qRT-PCR檢測(cè)胰島素信號(hào)通路基因InR在不同幼蟲中的表達(dá)情況。同1.5節(jié)中的方法，將黑腹果蠅卵在分別接種有植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，72 h后收集各組幼蟲100頭，用無(wú)菌水清洗體表，液氮速凍并研磨后，利用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，利用oligo dT引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Thermofisher)。以果蠅rp49基因作為內(nèi)參基因(rp49-F: 5′-CGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3′; rp49-R: 5′-AAACGCGGTTCAGCATGAGC-3′)，用FastStart通用型SYBR? Green預(yù)混液(Roche)檢測(cè)InR(InR-F: 5′-AACAGTGGCGGATTCGGTT-3′; InR-R: 5′-TACTCGGAGCATTGGAGGCAT-3′)的表達(dá)水平(Storellietal., 2011)。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，溶解曲線范圍為65～95℃。

1.7 數(shù)據(jù)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，qRT-PCR采用2-△△Ct計(jì)算分析基因的相對(duì)表達(dá)量(△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct樣品-△Ct對(duì)照)，3組實(shí)驗(yàn)重復(fù)。用Prism5.0軟件進(jìn)行繪圖，并用t檢驗(yàn)、Tukey氏多重比較檢驗(yàn)和雙因素方差分析分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同微生物對(duì)交配前后雌雄黑腹果蠅的引誘力差異

結(jié)果表明，未交配雌、雄黑腹果蠅成蟲都趨向于釀酒酵母和植物乳桿菌，尤其是釀酒酵母(P<0.001)，而對(duì)蘋果醋酸桿菌沒(méi)有明顯的趨性(圖1: A)。交配后的雌蠅對(duì)釀酒酵母和植物乳桿菌的趨性與雄蠅基本一致(P<0.001)，但雌蠅的趨性比雄蠅更明顯，值得注意的是，交配后的雌、雄果蠅對(duì)蘋果醋酸桿菌表現(xiàn)出不同的趨性，蘋果醋酸桿菌可以顯著引誘雌蠅(P<0.05)，而對(duì)雄蠅無(wú)明顯影響(圖1: B)。

圖1 不同微生物對(duì)未交配(A)和交配后(B)黑腹果蠅成蟲的引誘指數(shù)Fig. 1 Attraction index of different microbes to unmated (A) and mated (B) adults of Drosophila melanogasterSc: 釀酒酵母菌液Culture of Saccharomyces cerevisiae; Lp: 植物乳桿菌菌液Culture of Lactobacillus plantarum; Am: 蘋果醋酸桿菌菌液Culture of Acetobacter malorum; CK: 正常培養(yǎng)基(對(duì)照)Normal medium (control). 引誘指數(shù)Attraction index (AI)=(O-C)/T. O: 趨向菌液的果蠅數(shù)量Number of flies attracted by microbe culture; C: 對(duì)照組果蠅數(shù)量Number of flies in the control; T: 測(cè)試果蠅的總數(shù)Total fly number in the test. 下圖同The same for the following figures. 取1 mL OD600=1的微生物新鮮菌液清洗重懸為50 μL。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示每組數(shù)據(jù)與零相比的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05)(t檢驗(yàn))。1 mL fresh microbe culture with the OD600 value of 1 are washed and resuspended in 50 μL. Data in the figure are mean±SE. The asterisks above bars indicate the significance of differences of the data compared to zero (*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05) (t-test). 圖2和3同The same for Figs. 2 and 3.

進(jìn)一步對(duì)非處女蠅的檢測(cè)結(jié)果表明，與植物乳桿菌相比，釀酒酵母(P<0.01)和蘋果醋酸桿菌(P<0.001)對(duì)非處女蠅的引誘更強(qiáng)，但在釀酒酵母和蘋果醋酸桿菌之間沒(méi)有顯著差異(圖2: A)。而與單一的植物乳桿菌或蘋果醋酸桿菌相比，2種不同微生物的混合物或3種微生物的混合物都具有更強(qiáng)的吸引力；2種微生物的混合物對(duì)黑腹果蠅的引誘指數(shù)與單一釀酒酵母的相當(dāng)，但3種微生物混合物的引誘指數(shù)顯著高于單一釀酒酵母(P<0.001)。由此表明，與單一微生物相比，非處女蠅更趨向于不同微生物的混合物(圖2: B-E)。

圖2 不同微生物組合對(duì)黑腹果蠅非處女蠅的引誘指數(shù)Fig. 2 Attraction index of different microbe combinations to non-virgin Drosophila melanogasterA: 單一微生物與單一微生物比較 Single microbe versus single microbe; B-D: 兩種微生物的混合物與單一微生物比較Mixture of two microbes versus single microbe; E: 3種微生物的混合物與單一微生物比較Mixture of three microbes versus single microbe.

2.2 不同微生物對(duì)黑腹果蠅產(chǎn)卵選擇的影響

與在正常培養(yǎng)基(對(duì)照)上相比，黑腹果蠅非處女蠅都顯著偏好于在添加植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的培養(yǎng)基上產(chǎn)卵(P<0.001)(圖3: A)，該結(jié)果與非處女蠅對(duì)單一微生物的引誘實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明這3種微生物不僅可影響黑腹果蠅的覓食行為，也可影響其產(chǎn)卵選擇行為。非處女蠅在2種不同微生物之間的產(chǎn)卵選擇結(jié)果表明，與植物乳桿菌相比，黑腹果蠅更偏好于在含有蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的培養(yǎng)基上產(chǎn)卵(P<0.001)，而與釀酒酵母相比，黑腹果蠅更偏好于在含有蘋果醋酸桿菌的介質(zhì)上產(chǎn)卵(P<0.01)。由此可見(jiàn)，黑腹果蠅對(duì)3種微生物產(chǎn)卵選擇偏好依次是蘋果醋酸桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌(圖3: B)。而與單一微生物相比，黑腹果蠅更偏好于在含有2種或3種不同微生物的混合物的介質(zhì)上產(chǎn)卵(圖3: C-F)，該結(jié)果與引誘實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似，表明黑腹果蠅更偏好于在微生物多樣性更豐富的環(huán)境中產(chǎn)卵。

2.3 不同微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的影響

與在正常培養(yǎng)基(對(duì)照)中相比，黑腹果蠅幼蟲在分別含有植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌或釀酒酵母的培養(yǎng)基中發(fā)育更快，其中在含釀酒酵母培養(yǎng)基中發(fā)育最快，其次是含蘋果醋酸桿菌，最后是含植物乳桿菌(圖: 4)。由此表明，3種不同微生物都可以顯著促進(jìn)黑腹果蠅幼蟲的發(fā)育。

圖3 黑腹果蠅非處女蠅在不同微生物組合間的產(chǎn)卵指數(shù)Fig. 3 Oviposition index of non-virgin Drosophila melanogaster between different microbe combinationsA: 單一微生物與CK比較 Single microbe versus CK; B: 單一微生物與單一微生物比較Single microbe versus single microbe; C-E: 兩種微生物的混合物與單一微生物比較Mixture of two microbes versus single microbe; F: 3種微生物的混合物與單一微生物比較Three microbes versus single microbe. 產(chǎn)卵指數(shù)Oviposition index (OI)=(O-C)/(O+C). O: 添加微生物一側(cè)卵的數(shù)量Number of eggs at the side with microbe culture; C: 添加對(duì)照培養(yǎng)基一側(cè)卵的數(shù)量Number of eggs at the control side.

圖4 不同微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的影響Fig. 4 Effects of different microbes on the development of Drosophila melanogaster larvaeA: 在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)72 h的幼蟲Larvae grown on different media for 72 h; B: 在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)72 h的幼蟲體重Body weight of larvae grown on different media for 72 h. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, Tukey氏多重比較檢驗(yàn)). Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey’s multiple comparison test). 圖6同The same for Fig. 6.

圖5 釀酒酵母(A)、植物乳桿菌(B)和蘋果醋酸桿菌(C)對(duì)黑腹果蠅幼蟲到蛹發(fā)育的影響Fig. 5 Effects of Saccharomyces cerevisiae (A), Lactobacillus plantarum (B) and Acetobacter malorum (C)on the development of Drosophila melanogaster from larva to pupa將50粒黑腹果蠅卵移入分別接種了釀酒酵母、植物乳桿菌和蘋果醋酸桿菌培養(yǎng)基中，每日8:00和20:00統(tǒng)計(jì)化蛹數(shù)，至全部化蛹。Fifty eggs of D. melanogaster were transferred to the media inoculated with S.cerevisiae, L. plantarum and A. malorum, respectively, the numbers of pupae were counted at 8:00 am and 20:00 pm every day until complete pupation. live: 活菌Living microbe; die: 滅活菌Inactivated microbe. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，ns表示無(wú)顯著差異(P>0.05)(雙因素方差分析)。 Data in the figures are mean±SE. Different letters indicate significant difference (P<0.05), while ns indicates no significant difference (P>0.05) (two-way ANOVA analysis).

與對(duì)照正常50頭黑腹果蠅幼蟲在卵移入第7.0天全部化蛹相比，釀酒酵母活菌培養(yǎng)的果蠅幼蟲在第6.0天全部化蛹(圖5: A)，其他培養(yǎng)基中的果蠅幼蟲在第6.5天全部化蛹(圖5： B和C)。由此表明，3種不同微生物的活菌和滅活菌都可以加快黑腹果蠅幼蟲到蛹的發(fā)育。但蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母的活菌和滅活菌對(duì)黑腹果蠅化蛹時(shí)間的影響又不相同，尤其是釀酒酵母，接種活菌的果蠅幼蟲在第4.0天開始化蛹，接種滅活菌的果蠅幼蟲在第5.0天開始化蛹，同一時(shí)間點(diǎn)的接種活菌的蛹的數(shù)量都高于接種滅活菌和對(duì)照(圖5: A)。植物乳桿菌和蘋果醋酸桿菌對(duì)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的影響相似，接種活菌的果蠅幼蟲都在第4.5天開始化蛹，接種對(duì)應(yīng)滅活菌的果蠅幼蟲其化蛹時(shí)間與對(duì)照相同，都在第5.0天開始，但在第5.5天之后，果蠅幼蟲在接種植物乳桿菌或蘋果醋酸桿菌滅活菌和活菌培養(yǎng)基中的化蛹數(shù)接近，但都高于對(duì)照組的(圖5: B和C)。

2.4 不同微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲中胰島素信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

與對(duì)照(正常培養(yǎng)基上)相比，在接種蘋果醋酸桿菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h的果蠅幼蟲的InR表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與此相反，InR在接種植物乳桿菌或釀酒酵母培養(yǎng)基上培養(yǎng)的果蠅幼蟲中的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，且前者的顯著高于后者的(P<0.05)(圖: 6)。由此表明，在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，蘋果醋酸桿菌可激活黑腹果蠅胰島素信號(hào)通路，釀酒酵母和植物乳桿菌可抑制胰島素信號(hào)通路。

圖6 不同微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲中InR相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of different microbes on the relative expressionlevel of InR in Drosophila melanogaster larvae

3 討論

未交配和交配后雌雄果蠅對(duì)釀酒酵母和植物乳桿菌的趨性一致性(圖1: A)表明這兩種微生物可影響黑腹果蠅的覓食，而二者對(duì)雌性非處女蠅的吸引力高于對(duì)雄性的(圖1: B)，推測(cè)其可能也影響黑腹果蠅的產(chǎn)卵；而未交配和交配后雌、雄果蠅對(duì)蘋果醋酸桿菌的趨性差異暗示其可能主要影響果蠅的產(chǎn)卵。其中蘋果醋酸桿菌對(duì)交配前后雌、雄黑腹果蠅行為影響的差異目前暫未見(jiàn)報(bào)道。黑腹果蠅對(duì)單一微生物的產(chǎn)卵選擇實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母對(duì)果蠅的產(chǎn)卵選擇都具有顯著的吸引力，其中蘋果醋酸桿菌的影響最大，釀酒酵母其次，植物乳桿菌最小(圖3: A)。Qiao等(2019)的研究發(fā)現(xiàn)，果蠅非處女蠅對(duì)釀酒酵母和植物乳桿菌具有明顯的趨向性，而對(duì)蘋果醋酸桿菌則明顯趨避；對(duì)單一微生物的產(chǎn)卵偏好與本研究結(jié)果一致，都表現(xiàn)為顯著偏好。Fisher等(2017)的研究表明，果蠅對(duì)蘋果汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)的釀酒酵母和蘋果醋酸桿菌具有顯著的趨向性，但對(duì)植物乳桿菌的趨性不明顯。由此推測(cè)，果蠅非處女蠅對(duì)蘋果醋酸桿菌的趨性差異可能是由于不同實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的差異，造成培養(yǎng)物中相關(guān)代謝產(chǎn)物的差異，從而影響果蠅的選擇偏好。

此外，通過(guò)檢測(cè)黑腹果蠅對(duì)不同微生物及其混合物的覓食和產(chǎn)卵偏好，發(fā)現(xiàn)與單一微生物相比，黑腹果蠅更偏好于不同微生物的混合物。Fisher等(2017)的研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母與蘋果醋酸桿菌共同培養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變，相比單一微生物，黑腹果蠅更偏好于該兩種微生物的混合培養(yǎng)物。蘋果醋酸桿菌可利用植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸作為碳源，進(jìn)而提供植物乳桿菌生長(zhǎng)所必需的氨基酸和維生素，二者的互作可為宿主果蠅提供一系列代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)果蠅在不良環(huán)境情況下的發(fā)育(Consuegraetal., 2020; Henriquesetal., 2020)。由此表明，微生物的多樣性也可影響黑腹果蠅的取食和產(chǎn)卵行為。

通過(guò)檢測(cè)不同微生物對(duì)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌、蘋果醋酸桿菌和釀酒酵母都可以促進(jìn)黑腹果蠅幼蟲的發(fā)育，其中以釀酒酵母和蘋果醋酸桿菌的影響最大(圖4)。已有研究表明，釀酒酵母和蘋果醋酸桿菌可顯著促進(jìn)非處女蠅卵巢的發(fā)育，進(jìn)而提高雌性果蠅的產(chǎn)卵量，而植物乳桿菌無(wú)明顯影響(Qiaoetal., 2019)。此外，研究表明，果蠅成蟲和幼蟲對(duì)食物的偏好不同，雌性果蠅更偏好于在有利于成蟲而非幼蟲的介質(zhì)上產(chǎn)卵(Cooper, 1960)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，黑腹果蠅選擇在含有不同微生物的培養(yǎng)基上產(chǎn)卵，不僅有利于成蟲發(fā)育，同時(shí)也有利于幼蟲的發(fā)育。此外，3種微生物的活菌和滅活菌對(duì)果蠅幼蟲到蛹發(fā)育的影響也各不相同，活菌主要在早期加快幼蟲的化蛹，其中釀酒酵母活菌的影響最為明顯(圖5: A)，而主要作為營(yíng)養(yǎng)底物的滅活菌主要在中晚期促進(jìn)幼蟲到蛹的發(fā)育(圖5)，從而表明這些微生物不僅可作為營(yíng)養(yǎng)底物促進(jìn)黑腹果蠅發(fā)育，同時(shí)可能還與宿主果蠅存在不同程度的互作，在黑腹果蠅幼蟲發(fā)育中發(fā)揮作用。

胰島素信號(hào)通路是腸道微生物調(diào)控果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的主要途徑，其可通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯等促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)代謝等過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)胰島素信號(hào)通路負(fù)調(diào)控基因InR在接種不同微生物后黑腹果蠅幼蟲中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)蘋果醋酸桿菌可顯著抑制黑腹果蠅幼蟲InR的表達(dá)(圖6)。研究表明，蘋果醋酸桿菌可通過(guò)吡咯喹啉醌依賴性乙醇脫氫酶(pyrroquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenase, PQQ-ADH)依賴的氧化呼吸鏈產(chǎn)生的乙酸激活胰島素信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)黑腹果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育(Shinetal., 2011; 李玉娟等, 2017b)。由此表明，蘋果醋酸桿菌也可能通過(guò)胰島素信號(hào)通路調(diào)控黑腹果蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。而釀酒酵母和植物乳桿菌可顯著提高InR的表達(dá)，與二者促進(jìn)黑腹果蠅幼蟲發(fā)育的結(jié)果不一致。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌主要通過(guò)激活雷帕霉素靶蛋白(TOR)激酶活性，提高生長(zhǎng)速率，促進(jìn)黑腹果蠅幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育(Storellietal., 2011)，而不是胰島素信號(hào)通路。但李玉娟等(2017a)分離并鑒定到一種植物乳桿菌L.plantarumFY1可激活胰島素信號(hào)通路而非TOR信號(hào)通路，并促進(jìn)黑腹果蠅生長(zhǎng)發(fā)育，推測(cè)不同的植物乳桿菌菌株可能通過(guò)不同的分子機(jī)制調(diào)控果蠅發(fā)育。此外，早期研究認(rèn)為酵母菌對(duì)果蠅發(fā)育的影響主要是提供果蠅生長(zhǎng)發(fā)育所需要的底物(Anagnostouetal., 2010; Shinetal., 2011)，近年研究表明，酵母菌也可通過(guò)與果蠅的互作來(lái)影響宿主的生理活動(dòng)和發(fā)育(Padilla, 2016)。本研究也發(fā)現(xiàn)釀酒酵母也可能通過(guò)與黑腹果蠅的互作影響果蠅的行為和幼蟲發(fā)育過(guò)程，但其通過(guò)什么信號(hào)通路調(diào)控果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)果蠅腸道微生物植物乳桿菌和蘋果醋酸桿菌及環(huán)境中影響果蠅覓食的釀酒酵母均可影響黑腹果蠅的覓食偏好和產(chǎn)卵選擇偏好，其中蘋果醋酸桿菌主要影響黑腹果蠅的產(chǎn)卵，釀酒酵母和植物乳桿菌則可同時(shí)影響覓食和產(chǎn)卵，與單一微生物相比，黑腹果蠅在覓食和產(chǎn)卵選擇中都更偏向于不同微生物的混合物。同時(shí)，這些微生物在不同程度上都可通過(guò)與黑腹果蠅的互作促進(jìn)幼蟲的發(fā)育，但其調(diào)控機(jī)制不同。該研究結(jié)果不僅豐富了腸道微生物參與調(diào)控宿主行為和發(fā)育的研究，同時(shí)為進(jìn)一步研究不同腸道微生物與宿主互作的分子機(jī)制提供了依據(jù)。