魏洪媛, 豐國蕊, 許 鑫, 邵淑霞, 陳曉鳴, 楊子祥

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所, 國家林業(yè)和草原局資源昆蟲培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650224)

角倍蚜Schlechtendaliachinensis屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)癭綿蚜亞科(Eriosomatinae)五節(jié)根蚜族(Fordini)倍蚜屬Schlechtendalia(張廣學(xué)和陳小琳, 1999; Blackman and Eastop, 2007)，是五倍子的主要生產(chǎn)種，其在鹽膚木Rhuschinensis上寄生形成的蟲癭稱為角倍，約占五倍子總產(chǎn)量的70%，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值(張宗和, 1991; 楊子祥, 2011)。角倍蚜具有多種蟲型和復(fù)雜的生活史，包括有性生殖與孤雌生殖的繁殖方式及兩種寄主植物的轉(zhuǎn)主交替寄生。每年3月初，越冬若蚜在側(cè)枝匐燈蘚Plagiomniummaximoviczii等冬寄主上羽化為春遷蚜，遷飛到附近的鹽膚木樹干上，產(chǎn)雌雄性蚜，交配后的雌性蚜產(chǎn)干母，1齡干母沿著樹干爬到梢頭嫩葉上取食，刺激葉片細(xì)胞增生包裹自身形成蟲癭；4～5 d后干母在蟲癭內(nèi)蛻皮，變成2齡干母，繼續(xù)發(fā)育并經(jīng)歷3次蛻皮后發(fā)育成4齡成蚜。于6月中下旬產(chǎn)生干雌，蟲癭在干母和干雌的取食刺激下繼續(xù)生長；秋季，干雌發(fā)育成有翅秋遷蚜，蟲癭爆裂后遷飛到附近的冬寄主蘚上產(chǎn)若蚜越冬；次年春季，越冬若蚜發(fā)育成有翅春遷蚜，開始新的生活史循環(huán)(楊子祥, 2011; 邵淑霞等, 2012)。角倍蚜各蟲態(tài)均分泌蠟粉，以適合復(fù)雜多變的生活微環(huán)境，其中干雌和越冬若蚜分泌的蠟粉最多，蠟粉具有防水、保溫和防止病原菌寄生等功能(Weietal., 2020)。

昆蟲綱中半翅目、鱗翅目、膜翅目和鞘翅目等的部分種類也分泌蠟粉，其主要作用是在蟲體或卵的表面形成保護(hù)層，保護(hù)昆蟲免受雨水、病原微生物和天敵等危害(Chen and Qiao, 2012; 李嘉樂等, 2018)。蠟粉變化最豐富的是半翅目的蚜總科、蚧總科和蠟蟬總科，不同種類的蠟腺分布、發(fā)育程度、形狀和結(jié)構(gòu)等各不相同(Pope, 1983; Andrea and Emanuele, 2004; Qietal., 2019)；同一種類蠟腺的結(jié)構(gòu)和分布也隨著生存環(huán)境的不同而存在差異，如蘋果綿蚜Eriosomalanigerum的蠟粉分泌量隨著齡期的增加而增多，其寄生天敵的發(fā)生率隨著齡期增加而降低(Suetal., 2016)。

前人對角倍蚜的研究主要包括角倍蚜的生物學(xué)特性、生活史及其與寄主植物的相互作用等，但關(guān)于角倍蚜蠟腺的研究較少。本研究利用光學(xué)和電子顯微技術(shù)對角倍蚜各蟲態(tài)蠟腺的分布和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，分析各蟲態(tài)蠟腺的差異，探討蠟腺在角倍蚜生態(tài)環(huán)境適應(yīng)中的功能，為角倍蚜基礎(chǔ)生物學(xué)研究和人工培育技術(shù)的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

角倍蚜于2019年采集自云南省鹽津縣五倍子蚜培育基地(28°06′N, 104°22′E, 海拔980 m)， 10月初從成熟爆裂的蟲癭中采集有翅秋遷蚜，轉(zhuǎn)移到側(cè)枝匐燈蘚蘚圃上培育，讓秋遷蚜在蘚枝上產(chǎn)下若蚜；次年2-3月從蘚層中收集越冬若蚜和有翅春遷蚜，并將春遷蚜置于室內(nèi)培養(yǎng)，獲得雌雄性蚜，待雌雄性蚜交配后，收集產(chǎn)下的1齡干母。讓干母在鹽膚木葉片上取食形成蟲癭，收集癭內(nèi)的各齡干母和干雌。

1.2 光學(xué)顯微鏡觀察

采用Keyence VHX-1000數(shù)碼顯微系統(tǒng)或Olympus SZX16體式顯微鏡觀察癭內(nèi)外各蟲態(tài)的蠟粉、蘚枝上蠟球的結(jié)構(gòu)和自然形態(tài)等，并拍照。

將各蟲態(tài)角倍蚜(每個蟲態(tài)15頭)，置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.2)中固定12 h，轉(zhuǎn)至1%的四氧化鋨中固定2 h，經(jīng)丙酮分級脫水后，包埋在環(huán)氧樹脂Araldite中；用Leica EM UC6超薄切片機(jī)制作成1 μm的半薄切片，用甲基苯胺藍(lán)和勞氏紫Thionin染色，采用Olympus BX-51顯微鏡觀察蠟腺結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 透射電子顯微鏡觀察

將各蟲態(tài)角倍蚜(每個蟲態(tài)15頭)頭部切下，取蟲體部分置于2.5%戊二醛和磷酸鈉緩沖液中固定12 h，轉(zhuǎn)移至1%四氧化鋨冷溶液中固定12 h，經(jīng)丙酮分級脫水后，包埋于環(huán)氧樹脂Araldite中；用Leica EM UC6超薄切片機(jī)制作成70 nm的切片，用檸檬酸鉛和醋酸鈾酰雙重染色，采用Zeiss EM900透射電子顯微鏡觀察蠟腺結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察

在Olympus SZ61體視顯微鏡下對各蟲態(tài)蚜蟲表面的附著物進(jìn)行清理，將清理干凈的蚜蟲分為2組，每組15頭。 第1組直接置于Hitachi TM3000掃描電子顯微鏡下，觀察蟲體上蠟腺的數(shù)量和排列方式；第2組用70%， 80%， 90%， 95%和100%的乙醇依次進(jìn)行脫水，濾紙吸干；用導(dǎo)電膠將蟲體粘在樣品臺上，用Hitachi JS-1600離子濺射儀噴金，置于Hitachi TM3000電子顯微鏡下觀察蠟腺的結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 角倍蚜各蟲態(tài)蠟腺的數(shù)量和分布

角倍蚜所有6種蟲態(tài)(1齡干母除外)均有蠟腺，蠟腺縱向排列于蟲體背部，沿背部中線左右對稱分布，其中頭部2列2排、胸部4列1排、腹部6列8排(圖1: A, B, C)，共56個蠟腺。干母比較特殊，1齡干母沒有蠟腺(圖2: A)，2齡干母開始具有蠟腺，在腹部背面沿邊緣排列，有2列8排，共16個蠟腺，頭部和胸部背面沒有蠟腺(圖2: B)。

2.2 角倍蚜各蟲態(tài)蠟腺的結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步觀察蠟腺的顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)每個蠟腺由數(shù)量不等(2～22個)的多邊形凹陷組成，每個蠟腺附近通常伴生有1～2根感覺毛(圖2: B, C, D)。在所有6個蟲態(tài)中，干雌、春遷蚜和秋遷蚜的蠟腺復(fù)雜，每個蠟腺由10～14個凹陷組成，且蟲體各部位的蠟腺結(jié)構(gòu)沒有明顯差異(圖2: C, D)；越冬若蚜蠟腺的復(fù)雜程度次之，每個蠟腺由7～10個凹陷組成，蟲體各部位的蠟腺結(jié)構(gòu)沒有明顯差異(圖2: E)；性蚜各部位的蠟腺結(jié)構(gòu)差異顯著，靠近背板中線的脊柱板和胸膜板的蠟腺結(jié)構(gòu)簡單，由3～5個凹陷組成，而靠近邊緣線上的蠟腺結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由10～22個凹陷組成(圖2: F)；1齡干母沒有蠟腺(圖2: A)，2齡干母蟲體邊緣有蠟腺，由10多個凹陷組成，但蠟腺較其他蟲態(tài)小(圖2: B)。

2.3 角倍蚜蠟腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

超薄切片顯示，組成蠟腺的每個凹陷下對應(yīng)一個分泌細(xì)胞，由直接特化的表皮覆蓋，沒有導(dǎo)管或者導(dǎo)管細(xì)胞。分泌細(xì)胞的頂端分化出微絨毛，在微絨毛與特化的表皮之間形成儲液囊，蠟腺細(xì)胞間通過間隙連接(圖3: A)。分泌細(xì)胞中含有大量的線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，頂端微絨毛里含有大量的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖3: B, C)。

圖1 角倍蚜蠟腺的分布Fig. 1 The distribution of wax glands in the horned gall aphid, Schlechtendalia chinensisA: 角倍蚜蠟腺分布圖(蟲體圖仿張宗和, 1991)Wax gland distribution in the horned gall aphids (Aphid body diagram was imitated from Zhang, 1991); B： 蟲體背面的蠟腺縱切圖Wax glands of dorsal line by longitudinal section; C: 蟲體側(cè)面橫切圖Wax gland of lateral line by transverse section; D: 單個蠟腺的半薄切片縱切圖Single wax gland by semithin longitudinal section; E: 單個蠟腺的半薄切片橫切圖Single wax gland by semithin transverse section. mv: 微絨毛Microvilli; pd: 多邊形凹陷Polygonal depression; c: 單個蠟腺細(xì)胞Single wax gland cell.箭頭指蠟腺Arrows indicate wax glands.

圖2 掃描電鏡觀察的角倍蚜各蟲態(tài)蠟腺的形態(tài)和結(jié)構(gòu)Fig. 2 Morphology and structure of wax glands in various body forms of the horned gall aphid,Schlechtendalia chinensis observed using scanning electron microscopeA: 1齡干母1st instar fundatrix; B: 2齡干母2nd instar fundatrix; C: 干雌Fundatrigeniae; D: 秋遷蚜Fundatrispuriae; E: 越冬若蚜Apterae; F: 雄性蚜Sexual male. 箭頭示蠟腺。Arrows indicate the wax glands.

圖3 透射電鏡觀察的角倍蚜蠟腺的超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Ultrastructure of wax glands of the horned gall aphid, Schlechtendalia chinensisobserved using transmission electron microscopeA: 蠟腺Wax gland; B: 角倍蚜蠟腺細(xì)胞內(nèi)微絨毛(mv)中有大量的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SER)Apical microvilli (mv) of wax gland cell with lots of smooth endoplasmic reticulum (SER); C: 蠟腺細(xì)胞間的連接方式——間隔連接Intercellular junction of wax gland by separate junction. pd: 多邊形凹陷Polygonal depression; ss: 表皮下空間Subcuticular space; mv: 微絨毛Microvilli; N: 細(xì)胞核Nucleus; v: 分泌物囊泡Secretion vesicles; mi: 線粒體Mitochondria; sj: 間隔連接Separate junction.

圖4 不同生態(tài)環(huán)境中的角倍蚜各蟲態(tài)的照片和蠟粉分布Fig. 4 Photographs and wax distribution of various body forms of Schlechtendalia chinensisliving in different ecological environmentsA: 1齡干母1st instar fundatrix; B: 干雌，癭內(nèi)的干雌和蠟粉包裹蜜露形成的蠟球(wb)Fundatrigeniae and a large wax ball (wb) formed by wax wrapping honeydew in a gall; C: 秋遷蚜，蟲癭內(nèi)的有翅秋遷蚜和蠟粉Fundatrispuriae with wax in a gall; D: 越冬若蚜，蘚上被蠟粉包裹的越冬若蚜Apterae with wax in mosses; E: 性蚜，體表有蠟粉Sexual forms with wax on the body surface; F: 2齡干母，蟲癭內(nèi)蛻皮后的干母、蠟粉和蛻2nd instar fundatrix after molting, wax and exuviae in a gall.

2.4 角倍蚜各蟲態(tài)蠟粉的數(shù)量和分布

除1齡干母外(圖4: A)，角倍蚜各蟲態(tài)的體表均有蠟粉，其中干雌、春遷蚜和秋遷蚜分泌的蠟粉最多，癭內(nèi)干雌分泌大量蠟粉，包裹蟲體，脫落的蠟粉包裹蜜露、蛻等，有時甚至在癭內(nèi)形成大的蠟粉球(圖4: B)，遷飛前的秋遷蚜，蟲體間有大量的蠟粉(圖4: C)；越冬若蚜分泌蠟粉次之，蠟粉包裹自身，在蘚枝上形成松散的蠟球(圖4: D)；性蚜的蠟粉比越冬若蚜少(圖4: E)，沒有包裹蟲體；干母比較特殊，1齡干母(癭外)蟲體黑色、細(xì)長，體表光滑，沒有蠟粉(圖4: A)，2齡干母(癭內(nèi))蟲體淡黃色、短粗，體表有少量蠟粉(圖4: F)。

3 討論

3.1 角倍蚜各蟲態(tài)蠟腺的結(jié)構(gòu)變化及其對生活微環(huán)境的適應(yīng)

蚜蟲分泌的蠟粉具有良好的防水功能，對于在潮濕或寒冷環(huán)境中生活的蚜蟲來說更加重要。綠色云杉蚜Elatobiumabietinum可以在冬季經(jīng)歷幾次霜凍，是因?yàn)槠浔砻尕S富的蠟粉可以防止水分在蟲體表面凝固從而起到保護(hù)作用(Powell and Parry, 1976)。角倍蚜蠟腺結(jié)構(gòu)、形態(tài)和凹陷數(shù)量等在不同蟲態(tài)及同一蟲態(tài)的不同部位間差異顯著，其復(fù)雜程度與生活微環(huán)境密切相關(guān)，是角倍蚜對環(huán)境條件長期適應(yīng)的結(jié)果。角倍蚜干雌生活在完全封閉的蟲癭內(nèi)，相對濕度接近100%(劉平, 2014)，發(fā)達(dá)的蠟腺分泌大量的蠟粉，可以有效防止水汽在體表凝結(jié)和蟲體粘連。春遷蚜需要從貼近地面的潮濕蘚層中遷飛到鹽膚木樹干上，秋遷蚜需要從蟲癭裂口處遷飛到潮濕的蘚層中(邱明生和趙志模, 1995; 賴永祺等, 1986)，發(fā)達(dá)而均勻的蠟腺分泌蠟粉(圖4: C)，可以幫助保持體表干燥，有利于成功遷飛。越冬若蚜生活在貼近地面的高濕度的蘚層中，發(fā)達(dá)的蠟腺分泌大量蠟粉包裹蟲體(圖4: D)，可以有效隔離雨水和防止水汽在體表凝結(jié)，度過寒冷的冬季。有研究表明，與形成蠟球的角倍蚜個體相比較，未形成蠟球的個體死亡率較高(賴永祺等, 1990)。

性蚜由遷飛到鹽膚木樹干的春遷蚜在3月中上旬繁殖產(chǎn)生，在濕度較高的樹皮縫內(nèi)爬行、交配并隱蔽生活(唐覺和張傳溪, 1987)，蟲體背部邊緣線上蠟腺的復(fù)雜程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脊柱板和胸膜板上的蠟腺，因此蟲體的邊緣較背面分布有更多的蠟粉(圖4: E)，這可能是因?yàn)樾匝猎诔睗竦臉涓杀砻媾佬?，邊緣線上發(fā)達(dá)的蠟腺分泌較多的蠟粉可以隔離樹干表面的水。交配后的雌性蚜在鹽膚木樹干上繁殖產(chǎn)干母，1齡干母必須在1～2 d內(nèi)沿樹干爬到新萌發(fā)的嫩葉上取食，刺激葉片組織增生并形成蟲癭包裹自身，在癭內(nèi)繼續(xù)取食并蛻皮，完成從癭外到癭內(nèi)的轉(zhuǎn)變；1齡干母需要快速爬行到梢頭尋找嫩葉取食(唐翊峰, 2014)，蠟粉會影響其快速爬行，因此其蠟腺缺失或退化；當(dāng)干母被包裹進(jìn)封閉的蟲癭內(nèi)后，為適應(yīng)癭內(nèi)高濕度的微環(huán)境，干母蛻皮后出現(xiàn)蠟腺，分泌蠟粉防止水汽在體表凝結(jié)，保證了其正常的生存和繁殖。因此，干母在個體發(fā)育中蠟腺的從無到有，正是干母對從癭外到癭內(nèi)的微環(huán)境變化的適應(yīng)。

可以看出，經(jīng)過長期的進(jìn)化，角倍蚜各蟲態(tài)均具有與其生活微環(huán)境相適應(yīng)的蠟腺結(jié)構(gòu)，保證了種群的繁衍，但仍存在一些薄弱環(huán)節(jié)。如1齡干母沒有蠟腺，不能分泌蠟粉，如遇到初春的連續(xù)陰雨，將會由于缺乏蠟粉的保護(hù)而大量死亡；此外，秋季在蘚上初產(chǎn)的越冬若蚜，如遭遇陰雨，也會由于蠟粉分泌不足和蠟球未完成形成而死亡。因此，在角倍蚜培育過程中，可以有針對性地研發(fā)或改進(jìn)培育技術(shù)，如通過積溫調(diào)控干母發(fā)生時間，在蘚圃上覆蓋薄膜等，避開早春和晚秋的陰雨，可以有效降低初產(chǎn)干母和越冬若蚜的死亡率，提高五倍子產(chǎn)量。

3.2 角倍蚜蠟腺細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與功能

昆蟲的外分泌腺細(xì)胞根據(jù)表皮結(jié)構(gòu)和分泌物的分泌方式可以分為class 1和class 3，屬于class 1的腺體細(xì)胞被表皮細(xì)胞覆蓋，分泌物需要穿過表皮；而屬于class 3的腺體細(xì)胞與導(dǎo)管相連，分泌物通過導(dǎo)管到達(dá)細(xì)胞外(Noirot and Quennedey, 1974)。角倍蚜蠟腺細(xì)胞被表皮細(xì)胞覆蓋，蠟的分泌必須穿過表皮這個屏障，表明角倍蚜蠟腺分泌細(xì)胞屬于class 1(圖3: A)；蠟腺細(xì)胞中和頂端微絨毛中存在大量的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其作用是將脂類分泌物帶到微絨毛，然后通過微絨毛分泌，微絨毛增加了蠟腺細(xì)胞的面積，提高了分泌效率(Wangetal., 2018)。蠟腺細(xì)胞中存在大量的線粒體，可能是為蠟的分泌提供能量(Billenetal., 2017)。

3.3 角倍蚜蠟粉在癭內(nèi)封閉微環(huán)境中的保護(hù)功能

蚜蟲通過刺吸式口器取食植物汁液，食物中多余的大量含糖液體以蜜露的形式被排出。自由生長的蚜蟲通常排放大量的蜜露(Stadler and Müller, 1996)，一些生活在半封閉蟲癭內(nèi)的蚜蟲可以將蜜露、蠟粉和蛻等從開口處排出(Smith, 1999)。但角倍蚜大量的干雌(通常每個蟲癭內(nèi)5 000～8 000頭)生活在完全封閉的蟲癭內(nèi)長達(dá)150多天(Shaoetal., 2013; 陸沁等, 2018)，其排泄的大量蜜露是如何處理的呢？最新的研究表明角倍蚜蟲癭內(nèi)壁可以將蜜露吸收和再利用，成為蟲癭生長的營養(yǎng)來源之一(Chenetal., 2020)。除此之外，角倍蚜癭內(nèi)干雌發(fā)達(dá)的蠟腺分泌大量的蠟粉，可以將多余的蜜露和蛻等包裹，形成較大的蠟球(圖4: B)，有效地防止蜜露的污染和蟲體間的粘連。蟲癭的生長期為每年5-10月，跨越最熱的夏季，癭內(nèi)的高濕、高溫、封閉的環(huán)境和高糖的蜜露，具備了病原菌發(fā)生的良好條件，癭內(nèi)大量的蠟粉，還可以有效防止病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(Pikeetal., 2002)，保證了癭內(nèi)角倍蚜種群的正常生長和繁殖。前人的研究也證明山毛櫸蚜Phyllaphisfagi分泌的蠟粉可以防止黑色霉菌的發(fā)生(Smith, 1999)。

綜上所述，角倍蚜蠟粉的主要功能是防水和包裹蜜露等，各蟲態(tài)蠟腺的數(shù)量、排列和發(fā)達(dá)程度與其生活微環(huán)境和各蟲態(tài)的生物學(xué)特性密切相關(guān)，這些特征可能是角倍蚜對環(huán)境條件長期適應(yīng)的結(jié)果。隨著角倍蚜全基因組的發(fā)布，聯(lián)合基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定角倍蚜的泌蠟基因，分析泌蠟基因在各個蟲態(tài)間的表達(dá)差異，將有助于從分子層面揭示角倍蚜蠟腺在環(huán)境適應(yīng)和進(jìn)化中的生態(tài)學(xué)意義。