張淑娟，張育貴，李東輝，吳紅偉，牛江濤，司昕蕾，李越峰*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效，主要用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷等癥；炙黃芪為黃芪的蜜炙炮制加工品，炙黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，更長于益氣補(bǔ)中[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有提高機(jī)體免疫功能，抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[2-6]。除藥用外，黃芪作為保健品在國際保健食品界具有一定的地位，有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪蜜炙前后其化學(xué)成分及藥效均有一定的差異[7-11]。化學(xué)成分是藥物產(chǎn)生不同藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，故差異成分有可能是使黃芪與炙黃芪藥效改變的活性物質(zhì)。目前對黃芪化學(xué)成分的含量測定方面主要有單一成分以及多個(gè)成分同時(shí)測定，而關(guān)于蜜炙黃芪的質(zhì)量控制方面水平較低。研究表明，指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)含量測定在中藥材質(zhì)量控制和相近品種區(qū)分與鑒別等方面的應(yīng)用越來越廣泛[12-14]。本實(shí)驗(yàn)收集了15批黃芪藥材，擬采用HPLC法全面分析蜜炙黃芪化學(xué)成分，建立炙黃芪化學(xué)成分指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上，建立炙黃芪飲片中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III 8種成分的含量測定方法，并測定8種化學(xué)成分的含量?；诤繙y定結(jié)果，進(jìn)一步結(jié)合聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對不同產(chǎn)地炙黃芪飲片進(jìn)行區(qū)分與比較，并尋找差異性成分。基于以上實(shí)驗(yàn)研究，通過對不同產(chǎn)地多批炙黃芪飲片的分析，建立炙黃芪的質(zhì)量控制研究方法，以期能提升炙黃芪飲片的質(zhì)量控制水平，為炙黃芪飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 樣品 15批黃芪樣品為甘肅不同產(chǎn)地藥材，分別采集于甘肅隴南、隴西、渭源、岷縣、漳縣（表1），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)王明偉教授鑒定為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根。

表1 15批黃芪藥材信息Table 1 Information of 15 batches of Astragali Radix

1.1.2 試藥 對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)PS000687）、毛蕊異黃酮（批號(hào)PS010251）、芒柄花苷（批號(hào)PS000671）、芒柄花素（批號(hào)PS000674）、黃芪甲苷（批號(hào)PS010428）、黃芪皂苷I（批號(hào)PS000459）、黃芪皂苷II（批號(hào)PS000462）、黃芪皂苷III（批號(hào)PS200514-03）均購自成都普思生物科技有限公司，所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純購于天津大茂有限公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent公司）；HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器（DAD、ELSD檢測器）；BT125D型十萬分之一天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速離心機(jī)（美國科峻儀器公司）。

2 方法

2.1 黃芪飲片切制

將收集到的15批黃芪藥材去掉泥土，快速過水，沖洗干凈，悶潤，切成厚片（2～4 mm），干燥備用。

2.2 蜜炙黃芪飲片的制備

取一定量的黃芪飲片，加沸蒸餾水稀釋過的煉蜜悶潤1 h，黃芪每100 g用煉蜜25 g，水為蜜的20%。置炒鍋內(nèi)，130 ℃炒10 min，取出，放涼，篩去碎屑，即得蜜炙黃芪飲片。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取經(jīng)處理的炙黃芪飲片粉末4 g，置圓底燒瓶中，加甲醇40 mL，加熱回流2 h，過濾，減壓回收甲醇，殘?jiān)铀?0 mL，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次40 mL，合并正丁醇，加入氨試液洗滌2次（40 mL/次），棄去氨試液，減壓回收正丁醇，殘?jiān)舆m量甲醇使溶解，定容至5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III對照品適量，以甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度分別為0.403、0.325、0.344、0.104、7.278、1.022、1.010、1.002 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取這8種對照品儲(chǔ)存液各2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合對照品溶液，備用。

2.5 色譜條件

HC-C18色譜柱（Agilent公司，型號(hào)：Agilent 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5%～13% A；5～10 min，13%～21% A；10～23 min，21%～37%A；23～37 min，37%～53% A；33～43 min，53%～69% A；43～45 min，69%～100% A；體積流量1 mL/min；UV檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

HC-C18色譜柱（Agilent公司，型號(hào)：Agilent 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～5min，5%～13%A；5～10 min，13%～21% A；10～23 min，21%～37% A；23～37 min，37%～53% A；33～43 min，53%～69% A；43～50 min，69%～100% A；體積流量1 mL/min；ELSD：霧化溫度30 ℃；漂移管溫度105 ℃；氮?dú)饬髁?.5 L/min。

2.6 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一批炙黃芪飲片粉末（3號(hào)），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄指紋圖譜，以芒柄花素色譜峰為參照峰，計(jì)算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時(shí)間的RSD＜0.4%，各共有峰相對峰面積的RSD＜1.3%。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批炙黃芪飲片粉末（3號(hào)）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄指紋圖譜，以芒柄花素色譜峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD值分別小于2%、3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取炙黃芪飲片粉末（3號(hào)），按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以芒柄花素色譜峰為參照峰，結(jié)果各共有峰的相對保留時(shí)間RSD＜1.7%，相對峰面積RSD＜2.5%。

2.7 指紋圖譜的建立

取15批蜜炙黃芪飲片，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件測定，得到15批蜜炙黃芪飲片指紋圖譜，將得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012A版進(jìn)行分析，設(shè)置S1為參照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜（R），并對色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。經(jīng)過與對照品的比對，指認(rèn)了其中8個(gè)色譜峰，分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷（1號(hào)峰）、芒柄花苷（2號(hào)峰）、毛蕊異黃酮（3號(hào)峰）、芒柄花素（4號(hào)峰）、黃芪皂苷III（5號(hào)峰）、黃芪甲苷（6號(hào)峰）和黃芪皂苷II（7號(hào)峰）、黃芪皂苷I（8號(hào)峰）。將15批炙黃芪飲片指紋圖譜與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，得到15批不同產(chǎn)地炙黃芪飲片指紋圖譜，見圖1。結(jié)果各產(chǎn)地炙黃芪飲片HPLC-UV指紋圖譜相似度在0.949～0.999，均大于0.90，S1～S15相似度依次為0.992、0.985、0.949、0.997、0.998、0.999、0.984、0.994、0.997、0.997、0.996、0.992、0.994、0.998、0.994；HPLC-ELSD指紋圖譜相似度在0.959～0.998；S1～S15相似度依次為0.993、0.994、0.982、0.995、0.996、0.997、0.997、0.982、0.981、0.992、0.998、0.996、0.959、0.963、0.993，均大于0.90，表明15批炙黃芪飲片的整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜方法可用于炙黃芪飲片的鑒定和質(zhì)量控制。

圖1 15批炙黃芪樣品HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlay of HPLC fingerprint of 15 batches of Astragali Radix stir-frying with honey

2.8 炙黃芪飲片含量測定

2.8.1 混合對照品溶液制備 同“2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液的制備方法。

2.8.2 供試品溶液制備 同“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

2.8.3 色譜條件 同“2.5”項(xiàng)下方法。

2.8.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照“2.8.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。8個(gè)成分的線性回歸方程見表2。

表2 對照品的回歸方程Table 2 Regression equation of reference substance

2.8.5 精密度試驗(yàn) 取蜜炙黃芪飲片樣品（S3），按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄各個(gè)成分峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III峰面積的RSD分別為0.85%、0.55%、0.65%、0.45%、0.34%、0.74%、0.67%、0.78%。

2.8.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蜜炙黃芪飲片（S3）供試品溶液，按“2.8.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定各成分的峰面積，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III峰面積的RSD分別為1.01%、0.76%、0.83%、1.15%、1.41%、0.86%、1.02%、0.97%。

2.8.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取炙黃芪樣品（S3）粉末6份，按照“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.8.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，記錄峰面積。計(jì)算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.423%、1.344%、1.343%、1.325%、1.521%、1.434%、1.353%、1.458%。

2.8.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的炙黃芪飲片樣品（S3）粉末2 g，平行6份分別加入8種成分對照品適量，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣分析，記錄各化學(xué)成分峰面積。計(jì)算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III平均加樣回收率分別為98.3%、100.1%、98.2%、99.7%、98.8%、99.8%、98.5%、100.3%，RSD值分別為0.87%、0.65%、1.68%、1.79%、0.76%、0.73%、0.84%、1.26%。

2.8.9 樣品測定 按照“2.8.2”項(xiàng)下方法制備15批蜜炙黃芪飲片樣品溶液，按照“2.8.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，測定不同炙黃芪飲片中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III的含量，其中黃酮類成分采用HPLD-DAD測定，皂苷類成分采用HPLC-ELSD測定。炙黃芪樣品和混合對照品色譜圖見圖2。15批炙黃芪飲片含量測定結(jié)果見表3。

圖2 炙黃芪飲片樣品和混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chart of sample and mixed reference of processed Astragali Radix

表3 15批炙黃芪飲片中8個(gè)成分的含量 (n＝3)Table 3 Contents of eight components in 15 batches of processed Astragali Radix decoction pieces (n＝3)

2.9 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的不同產(chǎn)地炙黃芪飲片的比較與區(qū)分

為了進(jìn)一步比較與區(qū)分不同產(chǎn)地蜜炙黃芪飲片，尋找化學(xué)成分的差異，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法以測得的8種成分的含量為變量，對15批炙黃芪飲片進(jìn)行分析。

2.9.1 聚類分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件以15個(gè)不同產(chǎn)地蜜炙黃芪飲片各化學(xué)成分峰面積為變量，以平方歐氏距離（Euclidean距離）為區(qū)間，采用組內(nèi)均連法，對15批炙黃芪飲片指紋圖譜進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。峰面積進(jìn)行可視化展示，見圖3。由聚類分析結(jié)果可知，15批炙黃芪樣品可分為3類，15產(chǎn)地的為一類，4、6、10、14產(chǎn)地的聚為一類，1～3、5、7～9、11～13產(chǎn)地的聚為一類。

圖3 炙黃芪中各化學(xué)成分峰面積可視化圖Fig.3 Visualization diagram of peak area of each chemical component in processed Astragali Radix

2.9.2 主成分分析（PCA） 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)和區(qū)分不同產(chǎn)地的炙黃芪飲片，以所測定的8種成分的含量為變量進(jìn)行PCA。根據(jù)特征值和貢獻(xiàn)率選出主成分，結(jié)果見表4。以特征值＞1，提取出的主成分有3個(gè)，其累積貢獻(xiàn)率為73.543%，包含了15批炙黃芪指紋圖譜的主要信息，它們能夠反映炙黃芪的基本特征。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻(xiàn)越大，矩陣結(jié)果見表5。毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮在第1主成分中有明顯的載荷值；芒柄花素、黃芪皂苷I在第2主成分中有明顯的載荷值；黃芪皂苷III在第3主成分中有明顯的載荷值。表明影響炙黃芪飲片質(zhì)量差異性的是多個(gè)成分，而不是單一成分。運(yùn)用SIMCA-P 14.1分析軟件對其進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖4。由PCA圖可以看出，S15產(chǎn)地的炙黃芪飲片為一類，S4、S6、S10、S14產(chǎn)地的炙黃芪飲片為一類，其余產(chǎn)地的為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

表4 特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic values and cumulative variance proportion

表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Component matrixa

圖4 蜜炙黃芪飲片PCA圖Fig.4 PCA diagram of Astragali Radix decoction pieces stir-frying with honey

2.9.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為了進(jìn)一步區(qū)分15個(gè)不同產(chǎn)地炙黃芪飲片及尋找差異成分，在經(jīng)過PCA分析之后，進(jìn)一步采用OPLS-DA對炙黃芪飲片進(jìn)行分析。以8種化學(xué)成分的含量作為輸入變量得到相應(yīng)模型。結(jié)果見圖5、6。建立的OPLS-DA模型中，累積解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.629和0.686，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.765，R2和Q2均大于0.5，表明所建模型具有一定的穩(wěn)定性及可靠性?？捎糜谠u(píng)價(jià)與區(qū)分不同炙黃芪飲片。由OPLS-DA得分圖可知，與聚類分析和PCA分析結(jié)果相似，不同產(chǎn)地炙黃芪飲片被很好的分為3類。根據(jù)模型中變量權(quán)重要性排序（VIP）預(yù)測值來篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，選出VIP＞1.0的變量作為差異標(biāo)志物，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III和黃芪甲苷的VIP值分別為1.04、1.05、1.03、0.77、1.20、0.29、1.31、1.00，因此確定毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷I、黃芪皂苷III和黃芪甲苷為不同炙黃芪飲片的差異性化合物，可以作為區(qū)分和評(píng)價(jià)不同炙黃芪飲片的指標(biāo)性成分。

圖5 蜜炙黃芪飲片OPLS-DA圖Fig.5 OPLS-DA diagram of Astragali Radix decoction pieces stir-frying with honey

圖6 VIP值Fig.6 VIP value

3 討論

本研究采用HPLC法對15個(gè)不同產(chǎn)地的炙黃芪飲片進(jìn)行分析，建立了炙黃芪飲片化學(xué)指紋圖譜，結(jié)果顯示相似度均大于0.90，表明15個(gè)不同產(chǎn)地炙黃芪飲片所含化學(xué)成分基本一致，所建立的指紋圖譜可用于炙黃芪飲片的鑒定與質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)測定了不同產(chǎn)地炙黃芪飲片的8種化學(xué)成分的含量。結(jié)果顯示8種成分總量為0.997～5.118 mg/g，8種成分中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為0.225～4.138 mg/g、0.159～0.367 mg/g，芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為0.005～0.025 mg/g。而黃芪皂苷I和黃芪皂苷II質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大，分別為0.059～0.249 mg/g、0.061～0.100 mg/g。

為了更好地辨識(shí)炙黃芪飲片之間的質(zhì)量差異，采用PCA和OPLS-DA分析，將15批炙黃芪樣品分成了3類，篩選出了6個(gè)差異性質(zhì)量標(biāo)志物，分別是毛蕊異黃酮苷（1號(hào)峰）、芒柄花苷（2號(hào)峰）、毛蕊異黃酮（3號(hào)峰）、黃芪皂苷I（8號(hào)峰）、黃芪皂苷III（5號(hào)峰）和黃芪甲苷（6號(hào)峰）?？梢宰鳛閰^(qū)分和鑒別不同產(chǎn)地飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)。

本研究采用HPLC法建立了不同產(chǎn)地炙黃芪指紋圖譜，首次采用指紋圖譜結(jié)合PCA和OPLSDA可快速篩選出不同產(chǎn)地炙黃芪差異性質(zhì)量標(biāo)志物，并建立了含量測定方法。該方法能夠有效地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地炙黃芪質(zhì)量以及需關(guān)注的質(zhì)量標(biāo)志成分及含量，可為炙黃芪飲片的質(zhì)量控制提供科學(xué)的方法與依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突