劉思成，許言超，吳 耽，何文文，胡華林，朱偉明，王立平*

1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014

2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014

內(nèi)生菌廣泛分布于植物的各個部位[1]，且以互惠共生的寄生關(guān)系協(xié)同生長，宿主植物為內(nèi)生菌提供生長所需條件，內(nèi)生菌則代謝產(chǎn)生具有生理活性的物質(zhì)作為回報促進植物的生長及防御[2]。魚腥草Houttuynia cordataThunb.為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，主要分布于我國長江流域以南地區(qū)，包括貴州、江西、四川等省。魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效[3]，研究表明其主要化學(xué)成分包括黃酮、多糖、生物堿和揮發(fā)油等類成分[4]，是藥食兩用植物。魚腥草生命力較強，不易被病菌感染，目前已有對魚腥草內(nèi)生菌的抑菌活性報道[5-7]，但主要是內(nèi)生菌的分離及其發(fā)酵提取物的抑菌活性篩選。然而，對魚腥草內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的研究卻鮮有報道，本研究從1株魚腥草內(nèi)生菌Aspergillussp.GZWMJZ-636的發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了1個新的吲哚二酮哌嗪生物堿18-氧代曲普魯斯太汀B（18-oxotryprostatin B，1）和5個已知化合物，分別為1,2-裂環(huán)-殺錐曲菌素（1,2-seco-trypacidin，2）、?，F(xiàn)青霉素（questin，3）、短密青霉菌胺F（brevianamide F，4）、特來孢菌嗪D（terezine D，5）和去甲氧基煙曲霉素C（demethoxyfumitremorgin C，6），部分化合物對小麥赤霉病菌和辣椒枯萎病菌生長具有一定的抑制活性?；衔?～6結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1–6

1 儀器與材料

Bruker-600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（美國Bruker公司），Waters 2695 LCQ-MS質(zhì)譜儀（美國Waters公司），日立Primaide分析型高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），日立Primaide制備型高效液相色譜儀（日本Hitachi公司），魯?shù)婪駻UTOPOL1自動旋光儀（美國Rudolph公司）；柱色譜及薄層色譜用硅膠H（青島譜科分離材料有限公司），Sephadex? LH-20葡聚糖凝膠（瑞典Amersham公司），色譜柱（北京欣維爾），F(xiàn)A1104型電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），ZF-6型三用紫外線分析儀（上海嘉鵬科技有限公司），Air Tech潔凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司），LDZX-75KBS高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），ZWY-2112B恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。提取分離用醋酸乙酯、甲醇、丙酮、二氯甲烷、石油醚等均為分析純，液相用甲醇為色譜純。

魚腥草Houttuynia cordataThunb.采自貴州省黔南布依族苗族自治州龍里縣，由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室顧瑋副研究員鑒定。內(nèi)生菌Aspergillussp.GZWMJZ-636分離自魚腥草地下部分，菌株委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行ITS測序，NCBI數(shù)據(jù)庫blast比對，鑒定為曲霉屬，GenBank登錄號為No.MW440553。該菌株保藏于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。抑菌活性實驗所用的2種植物致病菌為小麥赤霉病菌Fusarium graminearum和辣椒枯萎病菌F.oxysporum，菌株由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室黃烈軍副研究員提供。

2 方法

2.1 菌株發(fā)酵

將保藏于4 ℃冰箱的菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。然后挑取單菌落接種到裝有真菌二號培養(yǎng)基（麥芽糖20 g、味精10 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、葡萄糖10 g、酵母膏3 g、玉米漿1 g、甘露醇20 g，自來水1000 mL）的錐形瓶中（150 mL/500 mL），在28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)（180 r/min）培養(yǎng)4 d，作為種子液使用。采用大米固體培養(yǎng)基（50 g大米，50 mL水）發(fā)酵，發(fā)酵量為5 kg，在28 ℃下靜置培養(yǎng)30 d。

2.2 活性產(chǎn)物的提取分離

發(fā)酵結(jié)束后的菌株用醋酸乙酯-甲醇（10∶1）分批攪拌提取3次，每次攪拌2 h，提取液減壓濃縮后得到粗提物180 g。提取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）洗脫，得到9個組分（Fr.1～9）。通過硅膠柱色譜對組分Fr.4（3.8 g）進行梯度洗脫，石油醚-醋酸乙酯（10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）洗脫，得到8個組分（Fr.4.1～4.8）。Fr.4.7用HPLC（半制備型，C18柱）制備（甲醇-水78∶22）得到化合物2（tR＝9 min，12.9 mg）。Fr.4.8通過凝膠柱色譜，甲醇-二氯甲烷（1∶1）洗脫，得到5個組分（Fr.4.8.1～4.8.5）。Fr.4.8.5用HPLC（半制備型，C18柱）制備（甲醇-水68∶32）得到化合物3（tR＝5 min，9.5 mg）。Fr.5（5.6 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（2∶1、1∶1、1∶2、1∶4）洗脫，得到10個組分（Fr.5.1～5.10）。Fr.5.2用HPLC（半制備型，C18柱）制備[甲醇-水（40∶60）]得到化合物6（tR＝9.3 min，12.0 mg）。Fr.6（4.6 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（30∶1）洗脫得到6個組分（Fr.6.1～6.6）。Fr.6.2用HPLC（半制備型，C18柱）制備[甲醇-水（55∶45）]得到化合物4（tR＝9.6 min，9.3 mg）。Fr.6.3用HPLC（半制備型，C18柱）制備[甲醇-水（55∶45）]得到化合物1（tR＝8.5 min，15.2 mg）。Fr.6.5用HPLC（半制備型，C18柱）制備[甲醇-水（65∶35）]得到化合物5（tR＝9.2 min，98.3 mg）。

2.3 抗植物病原菌活性評價方法

實驗分為藥物組和空白組，藥物組以DMSO溶解待測化合物，空白組為DMSO溶液。將待測化合物用DMSO配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，備用。配制PDA培養(yǎng)基，按10 mL定量分裝至50 mL錐形瓶中，在121 ℃滅菌30 min。藥物組每瓶加入待測化合物溶液10 μL，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，為給藥組；空白組用同樣方法定量加入10 μL DMSO溶液，待培養(yǎng)皿充分冷卻后，在各組平板中央接入直徑為5 mm病原真菌的菌餅，于28 ℃培養(yǎng)。當(dāng)空白組菌落長滿平板時，用十字交叉法測量各組的菌落直徑，計算各組均值，根據(jù)平均值計算化合物的抑菌率。

抑菌率=(空白組菌落直徑－藥物組菌落直徑)/空白組菌落直徑

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，高分辨質(zhì)譜m/z436.183 0 [M＋Na]+（計算值436.184 3，C22H27N3O5Na）提示化合物的分子式為C22H27N3O5。[α]20D?58.8°(c0.56)；紫外光譜顯示，在218 (2.97)、256 (1.19)、341 (2.87)、347 (2.79) nm 處有紫外吸收。3386,3272,2974,2855,1662,1576,1525,1451,1428,1382,1351,1304,1237,1163,1047,1021,910,815。通過分析其1H-和13C-NMR（表1）、DEPT和HSQC譜得知，化合物1有8個sp2季碳（δC193.7、169.5、165.7、158.8、137.6、132.9、122.4、121.9），3個sp2次甲基（δC118.8、111.9、93.7），1個sp3季碳（δC69.6），2個sp3次甲基（δC58.4、55.2），5個sp3亞甲基（δC52.3、44.9、27.5、25.0、22.3）及1個甲氧基（δC56.1）和2個同化學(xué)位移的甲基（δC29.8）。其核磁共振譜數(shù)據(jù)與已知化合物18-氧代曲普魯斯太汀A[8]非常接近，其差別主要在于異戊烯基雙鍵信號消失，以及增加了1個sp3亞甲基信號（δH/C3.01/ 52.3）和1個連氧的sp3季碳信號（δC69.6）。在HMBC譜（圖2）中，H2-19 (δH3.01) 與C-2、18、20、21、22，20-OH (δH4.72) 與C-19、20、21、22以及H3-21、22 (δH2.15)與C-19、20有長距離相關(guān)信號，提示異戊烯基的雙鍵與1分子水加成形成20-位叔醇結(jié)構(gòu)，水合后的異戊烯基通過C-18位與母核的C-2位相連。為確定化合物的立體構(gòu)型，進行了Marfey’s衍生化分析，脯氨酸部分被確定為L構(gòu)型。NOESY譜（圖3）中H-9（δH4.36）與H-12（δH4.13）的相關(guān)信號提示H-9與H-12在環(huán)的同側(cè)，化合物1的立體構(gòu)型確定為 (9S,12S)，命名為18-氧代曲普魯斯太汀B。

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù) (600/150 MHz,DMSO-d6)Table 1 NMR data of compound 1 (600/150 MHz,DMSO-d6)

圖2 化合物1主要的1H-1H COSY (粗線，H-5/H-7為遠(yuǎn)程偶合)、HMBC (箭頭) 相關(guān)信號Fig.2 Key 1H-1H COSY (bold lines,long-range coupling for H-5/H-7) and HMBC (arrows) correlations of compound 1

圖3 化合物1主要的NOESY相關(guān) (虛線箭頭)Fig.3 Key NOESY (broken arrows) correlation of compound 1

化合物2：白色粉末，分子式C18H18O7；ESI-MSm/z:345.1[M－H]?；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:6.91 (1H,s,H-2′),6.70 (1H,s,H-7),6.39 (1H,s,H-5),6.27 (1H,s,H-4′),3.64 (3H,s,5′-OMe),3.63(3H,s,1′-COOMe),3.34 (3H,s,4-OMe),2.27 (3H,s,H-6a)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:199.5 (s,C-3),165.9 (s,1′-COOMe),163.4 (s,C-7a),160.9 (s,C-4),158.3 (s,C-3′),156.8 (s,C-5′),147.9 (s,C-6),128.1 (s,C-1′),125.9 (s,C-2),110.2 (d,C-5),110.2 (s,C-3a),107.3 (d,C-2′),103.6 (d,C-7),103.3 (d,C-4′),56.1 (q,5′-OMe),56.0 (q,1′-COOMe),52.2 (q,4-OMe),22.0 (q,C-6a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[9]，故鑒定化合物2為1,2-裂環(huán)-殺錐曲菌素。

化合物3：黃色粉末，分子式C16H12O5；ESI-MSm/z: 283.0 [M－H]?；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.41 (1H,s,H-4),7.17 (1H,d,J=2.1 Hz,H-5),7.11 (1H,s,H-2),6.80 (1H,d,J=2.1 Hz,H-7),3.89(3H,s,8-OMe),2.38 (3H,s,H-11)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 186.5 (s,C-9),182.9 (s,C-10),163.9 (s,C-6),162.1 (s,C-8),146.8 (s,C-3),137.2 (q,C-10a),132.5 (s,C-4a),124.5 (d,C-2),119.4(d,C-4),114.8 (s,C-9a),112.5 (s,C-8a),107.9 (d,C-5),105.5 (d,C-7),56.6 (s,8-OMe),21.8 (q,3-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[10]，故鑒定化合物3為?，F(xiàn)青霉素。

化合物4：無色固體，[α]24D?117.6°(c5.68,MeOH)；分子式C16H17N3O2；ESI-MSm/z: 306.4 [M＋Na]+；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.87 (1H,s,NH-1),7.75 (1H,s,NH-10),7.58 (1H,d,J=7.5 Hz,H-4),7.34 (1H,d,J=7.5 Hz,H-7),7.19 (1H,s,H-2),7.06 (1H,t,J=7.5 Hz,H-6),6.97 (1H,t,J=7.5 Hz,H-5),4.31 (1H,m,H-9),4.05 (1H,m,H-12),3.37(1H,m,H-15),3.27 (1H,m,H-8),3.25 (1H,m,H-15),3.09 (1H,m,H-8),1.97 (1H,m,H-13),1.68 (1H,m,H-14),1.61 (1H,m,H-14),1.38 (1H,m,H-13)；13CNMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:169.1 (s,C-11),165.6(s,C-17),136.0 (s,C-7a),127.4 (s,C-3a),124.5 (d,C-2),121.0 (d,C-6),118.7 (d,C-4),118.3 (d,C-5),111.3 (d,C-7),109.3 (s,C-3),58.5 (d,C-12),55.3 (d,C-9),44.7 (t,C-15),27.7 (t,C-13),25.9 (t,C-8),21.9(t,C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[11]，故鑒定化合物4為短密青霉菌胺 F。

化合物5：白色粉末，[α]24D＋6.1°(c1.97,MeOH)；分子式C19H23N3O2；ESI-MSm/z:348.4 [M＋Na]+；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.84 (1H,s,NH-1),8.00 (1H,s,NH-10),7.92 (1H,s,NH-13),7.39(1H,d,J=7.0 Hz,H-4),7.05 (1H,s,H-2),6.87 (1H,t,J=7.0 Hz,H-5),6.81 (1H,d,J=7.0 Hz,H-6),5.38(1H,t,J=6.3 Hz,H-16),4.11 (1H,brs,H-9),3.62(1H,d,J=6.7 Hz,H-12),3.49 (2H,d,J=6.3 Hz,H-15),3.22 (1H,m,H-8),3.02 (1H,m,H-8),1.69(3H,s,H-18),1.69 (3H,s,H-19),0.48 (3H,d,J=6.7 Hz,H-20)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:167.9 (s,C-11),166.9 (s,C-14),134.7 (s,C-7a),131.8 (s,C-17),127.8 (s,C-3a),124.4 (d,C-2),124.1 (s,C-7),122.4 (d,C-16),120.0 (d,C-6),118.7 (d,C-5),116.7 (d,C-4),109.0 (s,C-3),55.4 (d,C-9),49.9 (d,C-12),29.1 (t,C-8),29.0 (q,C-15),25.6 (t,C-18),19.4 (q,C-19),17.7 (q,C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[12]，故鑒定化合物5為特來孢菌嗪 D。

化合物6：淡黃色粉末，[α]24D＋5.3°(c1.66,CHCl3)；分子式C21H23N3O2；ESI-MSm/z:372.5 [M＋Na]+；1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:11.02 (1H,s,NH-1),7.55 (1H,d,J=7.9 Hz,H-16),7.33 (1H,d,J=7.9 Hz,H-19),7.07 (1H,t,J=7.9 Hz,H-18),7.00(1H,t,J=7.9 Hz,H-17),5.95 (1H,d,J=9.6 Hz,H-3),4.87 (1H,d,J=9.6 Hz,H-21),4.28 (1H,m,H-6),4.28 (1H,m,H-12),3.44 (2H,m,H-9),3.36(1H,m,H-13),2.91 (1H,m,H-13),2.20 (1H,m,H-7),2.00 (1H,m,H-7),1.94 (3H,s,H-24),1.87 (2H,m,H-8),1.58 (3H,s,H-23)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:169.2 (s,C-5),165.5 (s,C-11),136.1 (s,C-20),134.3 (s,C-22),132.7 (s,C-2),125.9 (s,C-15),124.6 (s,C-21),121.0 (d,C-18),118.8 (d,C-17),117.9 (d,C-16),111.4 (d,C-19),105.0 (s,C-14),58.5(d,C-6),56.1 (d,C-12),49.9 (d,C-3),44.9 (t,C-9),27.9(t,C-7),25.5 (q,C-23),22.7 (t,C-8),21.4 (t,C-13),18.0(q,C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[13]，故鑒定化合物6為去甲氧基煙曲霉素C。

3.2 抑菌活性測試結(jié)果

對化合物1～6進行了2種植物致病真菌的抑制活性測試，當(dāng)待測化合物終質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，化合物2和3對小麥赤霉病菌的抑制率分別為21.4%、20.0%，對辣椒枯萎病菌抑制率分別為18.0%、20.9%。

4 討論

農(nóng)業(yè)致病菌的防治是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展面臨的重大難題，傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥因?qū)Νh(huán)境的污染而受到越來越多的關(guān)注，無公害的綠色農(nóng)藥已成為農(nóng)業(yè)致病菌防治的趨勢，可提高中草藥的品質(zhì)。內(nèi)生菌與宿主植物互惠共生且不造成宿主的病變，其代謝的具有抑菌活性物質(zhì)可能具有開發(fā)為新型無公害綠色農(nóng)藥的潛質(zhì)。本研究從1株魚腥草內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了6個化合物，化合物1為新的吲哚二酮哌嗪生物堿，化合物2和3對小麥赤霉病菌和辣椒枯萎病菌具有一定的抑制活性，可將其作為先導(dǎo)化合物進行研究，通過結(jié)構(gòu)改造提升化合物的抗植物病原菌活性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突