王光進(jìn) 何林波 馮小梅（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院眼科，瀘州 646000）

葡萄膜黑色素瘤是眼部疾病中常見(jiàn)惡性腫瘤之一，患者接受手術(shù)摘除眼球治療后仍有大部分患者死亡［1-3］。目前葡萄膜黑色素瘤發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因而探討葡萄膜黑色素瘤發(fā)病機(jī)制有助于提高該病的治療效果。微小RNA（microRNA，miR?NA）是一種非編碼單鏈小RNA分子，并可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過(guò)程而參與葡萄膜黑色素瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［4］。微小RNA-1294（mi?croRNA-1294，miR-1294）在上皮性卵巢癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-1294的表達(dá)可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖［5］。miR-1294在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-1294過(guò)表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移［6］。目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-1294與葡萄膜黑色素瘤之間的關(guān)系。StarBase預(yù)測(cè)顯示miR-1294與三結(jié)構(gòu)域蛋白28（tripartite motifcontain?ing protein 28，TRIM28）可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，研究表明TRIM28在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及遷移［7］。但miR-1294是否靶向調(diào)控TRIM28而影響葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲尚未可知。本研究首次在體外研究miR-1294對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，對(duì)探究葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制及提高臨床治療效果、改善患者預(yù)后均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司；葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；miR-1294模擬物（mimics）及其陰性對(duì)照（miR-NC）、TRIM28小干擾RNA（si-TRIM28）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）、miR-1294特異性寡核苷酸抑制劑（an?ti-miR-1294）及其陰性對(duì)照（anti-miR-NC）均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑（methylthia?zolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自重慶普立科生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matri?gel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；蛋白裂解液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸（bicincho?ninicacid，BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湖南艾佳生物科技股份有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1（Cy?clinD1）、p21、p27抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloprotein?ases-14，MMP-14）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人TRIM28多克隆抗體購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織來(lái)源：選取2017年6月至2018年10月本院收集的26例葡萄膜黑色素瘤患者為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為葡萄膜黑色素瘤，其中男15例，女11例，年齡46～70歲，平均年齡（59.74±6.57）歲，術(shù)中切除葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：miR-NC組（miR-NC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、miR-1294組（miR-1294 mimics轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、si-TRIM28組（si-TRIM28轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、miR-1294+pcDNA組（miR-1294 mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、miR-1294+pcDNA-TRIM28組（miR-1294 mimics與pcDNA-TRIM28共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞），轉(zhuǎn)染過(guò)程均按照Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染前1 h更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證miR-1294是否靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SP6.5細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組miR-NC組、miR-1294組、anti-miR-NC組（anti-miRNC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）、anti-miR-1294組（anti-miR-1294轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞）。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-1294、TRIM28 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織及細(xì)胞系總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，miR-1294正向引物5′-TGTGTGC?CAAGATCTGTTCA-3′，反向引物：5′-AGTTTCACCTCACTGCGTCCT-3′；GAPDH正向引物5′-GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物：5′-GGCT?GTTGTCATACTTCTCATGG-3′；TRIM28正向引物5′-AGCGGGTGAAGTACACCAAG-3′，反向引物：5′-ACCCAAAGCCATAGCCTTCC-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10μl，cDNA 2μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，ddH2O 6μl；反應(yīng)條件：95℃2 min（循環(huán)1次），95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s（循環(huán)40次）。TRIM28以GAPDH為內(nèi)參，miR-1294以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法 計(jì) 算miR-1294、TRIM28 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液后接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)每孔加入20μl MTT溶液，室溫孵育4 h，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜（di?methylsulfoxide，DMSO），充分混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處各孔吸光度值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/ml），Transwell小室的上室中每孔加入200μl細(xì)胞懸液，Transwell小室的下室每孔加入600μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌后采用多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，采用棉簽擦拭未遷移細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 采用預(yù)冷培養(yǎng)液按照9：1比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，Transwell小室上室中每孔加入40μl Matrigel稀釋液，室溫孵育5 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/ml），Transwell小室的上室中每孔加入200μl單細(xì)胞懸液，Transwell小室的下室中每孔加入600μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，使用棉簽擦拭未侵襲細(xì)胞，顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)StarBase預(yù)測(cè)顯示TRIM28的3′UTR中含有與miR-1294互補(bǔ)的核苷酸序列，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，分別將含有TRIM28的3′UTR結(jié)合位點(diǎn)序列及突變位點(diǎn)序列載入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-TRIM28與突變型載體MUT-TRIM28，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，分別 將WT-TRIM28、MUT-TRIM28與miR-NC、miR-1294 mimics共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞后檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot檢測(cè)TRIM28、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30 min后提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAG-E）分離蛋白，反應(yīng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫條件下孵育一抗稀釋液（TRIM28 1：500，CyclinD1 1：1 000，p21、p27 1：500，MMP-2、MMP-9、MMP-14 1：1 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液（1：2 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌，顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及Im?age J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤中的表達(dá) 與正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19相比，葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918中miR-1294的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），TRIM28 mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），其中miR-1294在葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，見(jiàn)圖1、表1。與瘤旁組織比較，葡萄膜黑色素瘤組織中miR-1294的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），TRIM28mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。因而選用葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 TRIM28蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of TRIM28

表1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.1 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma cells（±s，n=9）

表1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.1 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma cells（±s，n=9）

Note：Compared with ARPE-19 group，1）P＜0.05.

TRIM28 protein 0.23±0.03 0.61±0.061）0.49±0.041）0.53±0.051）113.162 0.000 Groups ARPE-19 SP6.5 MUM-2B C918 F P miR-1294 1.00±0.09 0.34±0.031）0.56±0.051）0.41±0.041）241.167 0.000 TRIM28 mRNA 1.01±0.08 2.63±0.261）2.34±0.231）2.52±0.241）110.601 0.000

表2 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)（±s，n=26）Tab.2 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma and peritumoral tissues（±s，n=26）

表2 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)（±s，n=26）Tab.2 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma and peritumoral tissues（±s，n=26）

Note：Compared with peritumoral tissues group，1）P＜0.05.

TRIM28 mRNA 1.02±0.09 2.52±0.241）29.840 0.000 Groups Peritumoral tissues Uveal melanoma tissues t P miR-1294 0.98±0.09 0.25±0.021）40.374 0.000

2.2 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中miR-1294的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），p21、p27蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Proliferation-related proteins expressions

表3 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-1294 overexpression on proliferation of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

表3 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-1294 overexpression on proliferation of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

OD（490 nm）Groups miR-1294 CyclinD1 p27 p21 0.29±0.03 0.68±0.051）20.065 0.000 24 h 0.39±0.04 0.36±0.03 1.800 0.090 48 h 0.73±0.06 0.45±0.041）11.648 0.000 72 h 1.14±0.09 0.58±0.051）16.317 0.000 miR-NC miR-1294 t P 1.00±0.08 2.36±0.231）16.754 0.000 0.76±0.07 0.31±0.031）17.726 0.000 0.25±0.03 0.63±0.061）16.994 0.000

2.3 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05），MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖3。

表4 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

表4 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MMP-14 protein 0.74±0.07 0.32±0.031）16.544 0.000 Groups miR-NC miR-1294 t P Number of migrating cells 106.54±9.36 49.87±4.581）16.315 0.000 Number of invasion cells 83.45±8.31 37.65±4.241）13.431 0.000 MMP-2 protein 0.67±0.03 0.25±0.031）29.698 0.000 MMP-9 protein 0.83±0.07 0.39±0.041）16.372 0.000

圖3 miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響Fig.3 Effects of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5Note：A.Transferring and invasion-related protein expression；B.Migra?tion and invasion of uveal melanoma cell SP6.5.

2.4 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-TRIM28組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），p21蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表5。

圖4 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation，migration and invasion of uveal mela-noma cells SP6.5

2.5 miR-1294靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá)starBase預(yù)測(cè)顯示TRIM28的3′UTR中含有與miR-1294互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖5A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染克隆有TRIM28-3′UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-1294組與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染克隆有TRIM28-3′UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-1294組熒光素酶活性明顯低于miR-NC組（P＜0.05），見(jiàn)表6。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中TRIM28蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組比較，antimiR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中TRIM28蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5B、表7。

圖5 miR-1294靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá)Fig.5 miR-1294 regulates expression of TRIM28

圖6 TRIM28過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用Fig.6 TRIM28 overexpression reversed effect of miR-1294 overexpression

2.6 TRIM28過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移和侵襲的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-1294+pcDNA組比較，miR-1294+pcDNA-TRIM28組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），p21蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6、表8。

表5 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation，migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

表5 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation，migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

OD（490 nm）Groups TRIM28 protein CyclinD1 protein p21 protein MMP-2 protein MMP-9 protein 24 h 48 h 72 h Number of migrating cells 0.40±0.04 0.38±0.03 1.200 0.247 si-NC si-TRIM28 t P 0.62±0.06 0.27±0.031）15.625 0.000 0.72±0.07 0.54±0.051）6.277 0.000 1.13±0.09 0.66±0.061）13.035 0.000 108.87±9.63 53.64±5.311）15.066 0.000 Number of in?vasion cells CyclinD1 protein 88.31±8.36 47.69±4.481）12.848 0.000 0.77±0.06 0.39±0.031）16.994 0.000 0.23±0.03 0.59±0.051）18.521 0.000 0.68±0.06 0.29±0.031）17.441 0.000 0.84±0.07 0.43±0.041）15.256 0.000

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05.

MUT-TRIM28 1.00±0.08 0.98±0.09 0.498 0.625 Groups miR-NC miR-1294 WT-TRIM28 1.02±0.09 0.41±0.041）18.580 0.000 t P

表7 miR-1294調(diào)控TRIM28蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 miR-1294 regulates expression of TRIM28 protein（±s，n=9）

表7 miR-1294調(diào)控TRIM28蛋白的表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 miR-1294 regulates expression of TRIM28 protein（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05；Compared with anti-miR-NC，2）P＜0.05.

TRIM28 protein 0.58±0.05 0.23±0.031）0.56±0.05 0.94±0.082）246.317 0.000 Groups miR-NC miR-1294 anti-miR-NC anti-miR-1294 FP

表8 TRIM28過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.8 TRIM28 overexpression reversed effects of miR-1294 overexpression on proliferation，migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

表8 TRIM28過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用（±s，n=9）Tab.8 TRIM28 overexpression reversed effects of miR-1294 overexpression on proliferation，migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05；compared with miR-1294+pcDNA，2）P＜0.05.

OD490 nm Groups TRIM28 protein p21 protein 24 h 48 h 72 h Number of migrating cells 109.32±9.64 48.69±4.851）46.87±4.66 Number of invasion cells 85.36±8.41 39.62±3.911）37.66±3.82 CyclinD1 protein MMP-2 protein MMP-9 protein miR-NC miR-1294 miR-1294+pcDNA miR-1294+pcDNATRIM28 0.63±0.05 0.21±0.031）0.22±0.02 0.41±0.04 0.37±0.03 0.35±0.03 0.74±0.07 0.49±0.041）0.47±0.04 1.15±0.09 0.69±0.061）0.64±0.05 0.79±0.06 0.33±0.031）0.31±0.03 0.24±0.03 0.64±0.061）0.65±0.06 0.69±0.06 0.27±0.031）0.26±0.03 0.82±0.07 0.38±0.031）0.37±0.04 0.51±0.052）0.39±0.04 0.61±0.052）0.93±0.08 89.36±8.252）71.45±7.132）0.67±0.062）0.36±0.032）0.57±0.052）0.69±0.06 166.800 0.000 F P 253.857 0.000 4.800 0.007 52.839 0.000 96.742 0.000 166.374 0.000 133.110 0.000 234.000 0.000 168.366 0.000 213.379 0.000

3 討論

葡萄膜黑色素瘤可嚴(yán)重影響患者視功能，針對(duì)原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤的治療方法主要包括手術(shù)與放療，但針對(duì)轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤尚無(wú)有效治療方法［8］。既往研究證實(shí)部分miRNA的異常表達(dá)在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)而發(fā)揮抑癌或致癌作用［9-10］。目前仍有部分miRNA在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用機(jī)制尚未闡明，因而本研究積極探尋新型miRNA并分析其在葡萄膜黑色素瘤中可能的分子機(jī)制，為葡萄膜黑色素瘤治療提供新方向。

miR-1294在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，并可能通過(guò)靶向調(diào)控HOXA6的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用［11］。研究表明miR-1294的表達(dá)下調(diào)預(yù)示胃癌患者的預(yù)后不良［12］。相關(guān)報(bào)道指出miR-1294的表達(dá)下調(diào)可促使C-MYC表達(dá)水平升高進(jìn)而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展［13］。與上述報(bào)道結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示miR-1294在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平低于正常葡萄膜上皮細(xì)胞系，提示miR-1294的表達(dá)水平降低可能促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生。本研究進(jìn)一步觀察miR-1294過(guò)表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，結(jié)果顯示miR-1294過(guò)表達(dá)后葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖能力明顯降低，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，提示miR-1294過(guò)表達(dá)可降低葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1294影響葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示miR-1294過(guò)表達(dá)后葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p21、p27蛋白表達(dá)水平均顯著升高，相關(guān)研究表明，CyclinD1與細(xì)胞蛋白依賴性激酶可結(jié)合形成復(fù)合物從而正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，p21、p27作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的一員，其可通過(guò)抑制細(xì)胞蛋白依賴性激酶活性而負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程［14-15］。細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤發(fā)生侵襲及浸潤(rùn)的先決條件，其中基質(zhì)金屬蛋白酶類可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子蛋白從而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，研究表明MMP-2、MMP-9、MMP-14等基質(zhì)金屬蛋白酶類在多種腫瘤組織及其細(xì)胞中均呈高表達(dá)，并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［16］。本研究結(jié)果提示miR-1294過(guò)表達(dá)可能通過(guò)降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14的表達(dá)水平及提高p21、p27的表達(dá)水平從而減弱葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

TRIM28在結(jié)直腸癌、食管鱗癌等腫瘤組織中表達(dá)水平升高，并可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程［17-18］。研究表明miR-140-3p可通過(guò)直接下調(diào)TRIM28的表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移［19］。相關(guān)報(bào)道指出抑制TRIM28的表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過(guò)抑制TRIM28的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活力顯著降低，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示干擾TRIM28的表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)從而降低葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1294能夠特異性結(jié)合TRIM28，并可負(fù)向調(diào)控TRIM28的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1294過(guò)表達(dá)聯(lián)合TRIM28過(guò)表達(dá)后，葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高，p21蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示miR-1294過(guò)表達(dá)可通過(guò)下調(diào)TRIM28的表達(dá)從而抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-1294在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而TRIM28的表達(dá)上調(diào)，miR-1294可能通過(guò)靶向TRIM28而調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，miR-1294在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因作用，可能成為葡萄膜黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)。