何曉麗 鐘先錦 龔菊梅 劉修樹（合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，合肥 238000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主［1］。在RA的發(fā)病過程中，Toll樣受體4/髓樣分子因子88/核因子-κB（TLR/MyD88/NF-κB）信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，阻斷由NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可防治RA的發(fā)生發(fā)展［2-3］。桔梗是常見的一種藥用植物，桔?？傇碥帐瞧渲饕钚猿煞?，具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用，在肺部疾病和炎癥相關(guān)性疾病中具有一定治療作用［4-5］。桔梗總皂苷可通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，如董雙勇等［6］研究發(fā)現(xiàn)桔?？傇碥胀ㄟ^抑制NF-κB的表達(dá)抑制急性肺損傷大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對急性肺損傷的保護(hù)作用。陳昭琳等［7］研究發(fā)現(xiàn)桔梗總皂苷通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮對RA大鼠的治療作用?？紤]NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，桔?？傇碥站哂锌寡缀鸵种芅F-κB信號通路的作用，本課題組對桔?？傇碥諏δz原性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用及對TLR/MyD88/NF-κB通路的影響進(jìn)行研究，探討桔?？傇碥赵谝种芌A炎癥反應(yīng)的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級、體重150～180 g、6～8周齡、Wistar大鼠購自北京醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，許可證號：SYXK（京）2015-0005。

1.1.2 主要試劑與儀器 桔?？傇碥眨ㄉ虾Ｔ慈~生物科技有限公司，純度98.2%），牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑（美國Chondrex公司）；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)科技有限公司）；伊紅、蘇木素、蛋白裂解液（RIPA）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗鼠TLR2單克隆抗體、兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠MyD88單克隆抗體、兔抗鼠p-NF-κB p65單克隆抗體、兔抗鼠NFκB單克隆抗體（美國Invitrogen公司）；BH-2型OLYMPUS顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 取70只大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、CKS低劑量組、CKS高劑量組、雷公藤多苷組，每組14只。

1.2.2 膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立 除對照組外，其他各組建立膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，具體方法為［8］：將10 ml牛Ⅱ型膠原（2 mg/ml）和等體積完全弗氏佐劑混合均勻，制成乳劑，備用。采用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后剪去大鼠尾根部和背部毛，皮內(nèi)多點(diǎn)注射0.25 mg牛Ⅱ型膠原乳劑，1周后再次注射，首次注射2周后，關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥4為造模成功。對照組大鼠采用同樣方法注射等量生理鹽水。

1.2.3 處理方法 造模成功后，CKS低劑量組和高劑量組大鼠分別給予CKS 100 mg/kg和200 mg/kg灌胃［7］，雷公藤多苷組大鼠給予雷公藤多苷12 mg/kg灌胃作為陽性對照組，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。共12 d。

1.2.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)計(jì)算 所有大鼠于建模前、建模后、給藥28 d時觀察關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度變化。0分：未見腫脹；1分：足趾關(guān)節(jié)微見腫脹；2分：足趾關(guān)節(jié)和小趾關(guān)節(jié)可見腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下足爪見腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部關(guān)節(jié)腫脹。關(guān)節(jié)炎指數(shù)=4只肢體關(guān)節(jié)評分之和，最高分16分，≥4分為造模成功。對于造模失敗大鼠，取正常大鼠重新造模，取造模成功者補(bǔ)充上述造模失敗大鼠。

1.2.5 標(biāo)本采集 于給藥第28天時處死大鼠，取大鼠右踝關(guān)節(jié)，用多聚甲醛固定，硝酸溶液脫鈣，脫水，石蠟包埋，切成厚0.4μm切片，用于HE和免疫組化染色檢測；取大鼠左踝關(guān)節(jié)，切取滑膜組織，用于ELISA和Western blot檢測。

1.2.6 HE染色 取大鼠踝關(guān)節(jié)切片組織，常規(guī)進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化。

1.2.7 踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪碎、勻漿，8 000 r/min離心12 min，取上清液，再12 000 r/min離心30 min，采用ELISA法測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.8 滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平測定 取大鼠滑膜組織，加入EP管中，加入1 ml RIPA裂解液和10μl蛋白酶抑制劑混合，裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用Western blot測定滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平。經(jīng)常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：兔抗鼠TLR2單克隆抗體、兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠MyD88單克隆抗體、兔抗鼠p-NFκB p65單克隆抗體，稀釋比例1∶300，過夜孵育，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測，采用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。以βactin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指標(biāo)、踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水 平、踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平、踝關(guān)節(jié)滑膜組織NFκB蛋白IOD值經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指標(biāo)值比較0 d時，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其他各時間點(diǎn)各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組比較，CKS組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)值比較（±s，n=14）Tab.1 Comparison of arthritis index values of rats in each group（±s，n=14）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)值比較（±s，n=14）Tab.1 Comparison of arthritis index values of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

35 d 10.35±0.91 7.52±0.931）6.89±0.871）6.65±0.911）49.659 0.000 Groups Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P 0 d 9.31±1.12 9.27±0.98 9.23±1.32 9.24±1.25 0.013 0.998 7 d 11.12±1.17 9.93±1.141）9.44±1.121）9.39±1.181）6.818 0.000 14 d 10.65±1.01 9.47±1.061）8.68±1.211）8.61±1.171）10.130 0.000 28 d 10.57±0.93 8.67±0.881）7.23±0.921）7.14±0.971）42.155 0.000

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色 對照組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)清晰完整，滑膜組織表層滑膜細(xì)胞排列整齊，關(guān)節(jié)面和滑膜層平整光滑，關(guān)節(jié)腔無增生纖維組織，關(guān)節(jié)骨組織和軟骨組織結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)增生性滑膜炎表現(xiàn)，滑膜細(xì)胞增生、排列紊亂，滑膜組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜下層血管充血擴(kuò)張，形成血管翳，關(guān)節(jié)腔中纖維結(jié)締組織增生，關(guān)節(jié)腔隙變窄，關(guān)節(jié)骨組織和軟骨組織破壞；CKS低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)輕，滑膜下結(jié)締組織中度充血，關(guān)節(jié)腔隙變窄減輕，關(guān)節(jié)骨組織和軟骨組織被破壞程度減輕；CKS高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞顯著減輕，滑膜細(xì)胞增生顯著減少，少量炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜下結(jié)締組織輕度充血，關(guān)節(jié)骨組織和軟骨組織破壞較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色（×40）Fig.1 HE staining of synovial tissue of ankle joint of rats in each group（×40）

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高；與模型組比較，CKS各劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低。見表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（±s，n=14）Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-6 and TNF-αlevels in synovial tissue of rats in each group（±s，n=14）

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（±s，n=14）Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-6 and TNF-αlevels in synovial tissue of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

TNF-α（ng/L）127.59±21.43 352.46±28.711）171.43±27.541）2）157.38±33.511）2）154.29±31.241）2）139.202 0.000 Groups Control Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P IL-1β（ng/L）31.24±5.03 102.37±6.421）55.42±6.281）2）38.24±5.861）2）36.58±6.021）2）337.435 0.000 IL-6（ng/L）43.52±6.26 75.43±7.021）54.16±7.021）2）47.98±7.241）2）46.57±7.131）2）47.885 0.000

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平升高；與模型組比較，CKS各劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平降低。見表3、圖2。

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較（±s，n=14）Tab.3 Levels of TLR2，TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65 protein in synovial tissues of rats in each group（±s，n=14）

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較（±s，n=14）Tab.3 Levels of TLR2，TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65 protein in synovial tissues of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

p-NF-κB p65 0.11±0.03 0.83±0.091）0.32±0.051）2）0.14±0.021）2）0.15±0.031）2）499.023 0.000 Groups Control Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P TLR2 0.09±0.03 0.43±0.061）0.24±0.051）2）0.13±0.031）2）0.14±0.021）2）157.964 0.000 TLR4 0.07±0.02 0.55±0.071）0.29±0.061）2）0.21±0.041）2）0.19±0.031）2）197.228 0.000 MyD88 0.13±0.03 0.62±0.081）0.28±0.061）2）0.15±0.021）2）0.16±0.031）2）241.959 0.000

3 討論

桔梗為桔?？浦参锝酃５母稍锔?，為常用中藥之一，具有排膿、祛痰、利咽、宣肺等功效［9-10］。桔梗中含有大量皂苷，皂苷是桔梗藥理活性的主要成分［11］。近年研究發(fā)現(xiàn)桔?？傇碥站哂锌寡鬃饔?，如姚琳等［12］研究發(fā)現(xiàn)桔?？傇碥湛赏ㄟ^抑制炎癥細(xì)胞因子引起的肺組織炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到抑制肺纖維化進(jìn)程，發(fā)揮對急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用；CHOI等［13］研究發(fā)現(xiàn)桔?？傇碥站哂袦p輕氣道炎癥的作用。RA為一種炎癥性疾病，滑膜中炎癥細(xì)胞因子水平升高［14］。本研究通過建立RA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，HE染色顯示大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)增生性滑膜炎表現(xiàn)。RA大鼠踝關(guān)節(jié)中炎癥細(xì)胞因子水平升高，炎癥反應(yīng)在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。RA大鼠給予低劑量和高劑量桔?？傇碥罩委熀?，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低，踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，HE染色顯示大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)增生性滑膜炎表現(xiàn)明顯減輕，且呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致，表明桔梗總皂苷具有抗炎作用，在RA中可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療作用。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平升高，NF-κB蛋白IOD值升高；給予各劑量桔?？傇碥崭深A(yù)后，大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平降低，NF-κB蛋白IOD值降低。TLR/MyD88/NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，TLRs參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)，TLR2和TLR4是該家族重要成員，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［15-16］。MyD88為TLRs通路的關(guān)鍵分子，通過傳遞TLRs信息，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展過程［17］。TLR2和TLR4可通過相應(yīng)的配體和MyD88相結(jié)合，激活下游NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，形成活化的NF-κB（p-NF-κB p65為NF-κB的活化形式），啟動炎癥介質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平升高［18］。TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65水平升高，表明TLR/MyD88/NF-κB信號通路被激活［19］。在RA發(fā)病過程中，TLR/MyD88/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用，抑制TLR/MyD88/NFκB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對RA具有保護(hù)作用［20］。桔?？傇碥兆鳛槌Ｓ弥兴?，可通過NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用，如桔?？傇碥湛赏ㄟ^抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎毒性［21］；桔?？傇碥湛赏ㄟ^抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減輕特應(yīng)性皮炎樣皮膚損傷［22］。結(jié)合既往研究及本研究結(jié)果，推測桔?？傇碥湛赡芡ㄟ^抑制TLR/MyD88/NF-κB信號通路激活，進(jìn)而抑制其下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對RA的保護(hù)作用。

綜上所述，桔?？傇碥湛赏ㄟ^抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮對RA的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制TLR/MyD88/NF-κB信號通路的激活有關(guān)。