黃河，周瑞，劉星，劉應(yīng)才

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000

心肌組織具有極其豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，能夠顯著影響心肌灌注。糖尿病心肌微血管病變?cè)斐尚募∥⒀苊芏葴p少，引起心臟灌注不足，導(dǎo)致心血管不良事件的發(fā)生［1］。因此，治療糖尿病微血管病變、改善心肌微血管功能對(duì)于建立缺血心肌側(cè)支循環(huán)、改善患者預(yù)后十分重要。但目前對(duì)糖尿病微血管病變尚無有效的治療措施。有研究顯示，局部補(bǔ)充血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心功能［2-3］。微小RNA（miRNA）是一種單鏈、非編碼的內(nèi)源性非編碼RNA，其主要作用是通過降解mRNA或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在心血管系統(tǒng)中，miRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)在心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、心率維持、血管生成方面起重要作用［4］。Let-7是目前研究最廣泛的mi RNA家族之一，其在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，與心臟肥厚、心臟纖維化等病理過程以及擴(kuò)張型心肌病、心肌梗死、心律失常、高血壓病等心血管疾病密切相關(guān)［5］。同時(shí)，Let-7可調(diào)控血管生成，Let-7能夠以Argonaute蛋白1（AGO1）為靶點(diǎn)介導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，即Let-7/AGO1/VEGF信號(hào)通路，最終促進(jìn)血管生成［6-7］。但Let-7/AGO1/VEGF信號(hào)通路是否在糖尿病心肌微血管病變中同樣能起到血管生成作用，從而改善心肌微血管病變，目前尚不明確。Let-7f-5p是Let-7家族成員，其與心肌缺血、維持血管完整性等關(guān)系密切，但其在糖尿病微血管病變中的作用鮮見報(bào)道。我們的前期研究顯示，糖尿病大鼠心肌組織Let-7f-5p表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下降［8］。2019年10月—2020年4月，我們通過腺病毒轉(zhuǎn)染的方式分別上調(diào)和下調(diào)糖尿病大鼠心肌組織Let-7f-5p表達(dá)，觀察AGO1和VEGF在mRNA及蛋白水平的變化，觀察Let-7f-5p對(duì)心肌微血管病變的影響并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠25只，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)房空氣流通，溫度22～26℃，光照時(shí)間12 h/d。普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 Let-7f-5p過表達(dá)及干擾表達(dá)腺相關(guān)病毒載體委托北京邁津生物科技公司構(gòu)建。空病毒原液構(gòu)自北京邁津生物科技公司。羅氏血糖儀、血糖試紙（德國(guó)羅氏公司）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；兔來源CD31抗體（Afinity公司）；總RNA提取試劑、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒（ELK Biotechnology）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、蘇木素染液、伊紅染液（ASPEN公司）。GE Vivi-E9心血管超高端彩超（美國(guó)GE公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（Life technolo?gies）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（Diatek公司）；普通光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組5只和糖尿病模型組20只。正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)全程予以自由飲水、常規(guī)飼料喂養(yǎng)。糖尿病模型組給予高脂高糖飼料（配方為10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規(guī)飼料）喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg STZ；注射72 h后，使用羅氏快速血糖儀行尾靜脈血糖檢測(cè)，以3次隨機(jī)血糖值>16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。取造模成功的大鼠15只，隨機(jī)分為空病毒組、Let-7f-5p過表達(dá)組、Let-7f-5p抑表達(dá)組，每組各5只。

1.3 干預(yù)方法 Let-7f-5p過表達(dá)組尾靜脈一次性注射Let-7f-5p過表達(dá)病毒原液50μL，Let-7f-5p抑表達(dá)組尾靜脈一次性注射Let-7f-5p抑制表達(dá)病毒原液50μL，空病毒組尾靜脈一次性注射等體積空病毒原液。隨后三組大鼠繼續(xù)自由飲水、高脂高糖飼料喂養(yǎng)12周。

1.4 心臟功能檢查 所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剪去胸前區(qū)毛發(fā)，涂抹適量醫(yī)用超聲耦合劑，使用彩色多普勒超聲顯像儀（GE Vivid E9）進(jìn)行心臟超聲檢查。探頭頻率3.5 MHz，記錄左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVIDs），計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（FS）。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠固定，開胸取出心臟，剪去多余血管和心房組織。取左心室心肌組織，分成約5 mm×5 mm×3 mm若干小塊，一部分加入4%多聚甲醛固定，用于免疫組化；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于RT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

1.6 心肌毛細(xì)血管密度檢測(cè) 采用兔來源CD31單抗免疫組化染色。取4%多聚甲醛固定的心肌組織，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟、水化，取心肌橫切面切片，置于3%H2O2中，室溫避光孵育。加入兔來源CD31一抗50μL，4℃過夜。每張切片加100μL HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃孵育50 min。DAB染色，蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察抗CD31抗體染色陽性的心肌毛細(xì)血管數(shù)量。從每個(gè)切片中隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的觀察者計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)量和心肌細(xì)胞核，計(jì)算毛細(xì)血管數(shù)量/心肌細(xì)胞核比值（C/M），取平均值用于評(píng)估心肌毛細(xì)血管密度。

1.7 心肌組織Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取凍存心肌組織約20 mg，加入1 mL預(yù)冷的TRIpure充分研磨，至心肌組織全部溶解。采用TRIzol法提取心肌組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cRNA。以cDNA為模板，使用StepOne?Real-Time PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Master Mix 5μL，2.5μmol/L引物工作液1μL，Template 1μL，ddH2O 2μL，ROX參比染料1μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃15 s，60℃60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，let-7f-5p以U6為內(nèi)參進(jìn)行計(jì)算，AGO1、VEGF mRNA以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行計(jì)算。

表1 目的基因及內(nèi)參引物序列

1.8 心肌組織AGO1、VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取心肌組織勻漿，加入適當(dāng)細(xì)胞總蛋白提取試劑，振蕩、吹打，使細(xì)胞完全裂解。4℃、13 000 g離心5 min，收集上清液，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為40μg。將處理完畢的蛋白樣品通過電泳電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入封閉液，室溫封閉1 h。加入一抗（稀釋比例1∶1 000）4℃過夜。TBST沖洗，加入二抗（稀釋比例1∶10 000），室溫孵育30 min。TBST沖洗。滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白側(cè)，暗室中曝光。根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，用GAPDH條帶進(jìn)行灰度值校正。以各條帶與GAPDH條帶的吸光度之比計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心臟功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，空病毒組、Let-7f-5p過表達(dá)組、Let-7f-5p抑表達(dá)組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低（P均<0.05）。Let-7f-5p過表達(dá)組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS較空病毒組增加，Let-7f-5p抑表達(dá)組LVIDd、LVIDs、LVEF、FS較空病毒組降低（P均<0.05）。見表2。

2.2 各組心肌微血管密度比較 空病毒組、Let-7f-5p過表達(dá)組、Let-7f-5p抑表達(dá)組、對(duì)照組C/M分別為0.48±0.07、0.66±0.05、0.28±0.05、1.49±0.28。與對(duì)照組比較，其他三組C/M均降低；與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達(dá)組C/M增加，Let-7f-5p抑表達(dá)組C/M降低（P均<0.05）。

表2 各組心臟功能指標(biāo)比較（±s）

表2 各組心臟功能指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達(dá)組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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2.3 各組心肌組織中Let-7f-5p及AGO1、VEGF mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，空病毒組、Let-7f-5p抑制表達(dá)組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達(dá)均降低，AGO1 mRNA表達(dá)升高（P均<0.05）；與空病毒組比較，Let--7f-5p抑表達(dá)組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達(dá)降低，AGO1 mRNA表達(dá)升高（P均<0.05）；Let-7f-5p過表達(dá)組心肌組織Let-7f-5p及VEGF mRNA表達(dá)升高，AGO1 mRNA表達(dá)降低（P均<0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組心肌組織中Let-7f-5p、AGO1、VEGF mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達(dá)組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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2.4 各組心肌組織AGO1、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，空病毒組心肌組織AGO1蛋白表達(dá)升高，VEGF蛋白表達(dá)降低（P均<0.05）；與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達(dá)組心肌組織AGO1蛋白表達(dá)降低、VEGF表達(dá)升高，Let-7f-5p抑表達(dá)組心肌組織AGO1蛋白表達(dá)升高、VEGF表達(dá)降低（P均<0.05）。見表4。

表4 各組心肌組織中AGO1及VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組心肌組織中AGO1及VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Let-7f-5p過表達(dá)組比較，#P<0.05；與空病毒組比較，△P<0.05。

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3 討論

糖尿病微血管病變可導(dǎo)致心肌灌注不足、心肌能量代謝障礙、心肌肥厚、心室壁硬度增加、心肌收縮和舒張功能障礙等心肌結(jié)構(gòu)和功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［9］。VEGF是影響血管生成的主要因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF的作用下，遷移至血管周圍間隙，再通過黏附、分裂、增殖、重構(gòu)等過程，最終形成新生的毛細(xì)血管［10］。ISNER等［11-12］報(bào)道，對(duì)下肢慢性缺血性閉塞患者通過肌肉內(nèi)注射或球囊直接血管內(nèi)給藥的方式局部補(bǔ)充VEGF，可促進(jìn)缺血區(qū)域的側(cè)支循環(huán)形成，改善遠(yuǎn)端肢體血流，表明通過局部補(bǔ)充VEGF可以改善缺血組織病變。在糖尿病大鼠模型中，增加心臟中VEGF的表達(dá)后，大鼠心肌微血管密度增加，心肌血流量提高，最終改善了心臟功能［2-3，13］。這表明局部增加心肌中VEGF的表達(dá)可能是糖尿病微血管病變潛在的治療方向。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LVIDd、LVIDs、LVEF、FS均降低，表明表現(xiàn)為心臟收縮功能減弱，出現(xiàn)了心臟功能障礙；CD31單抗免疫組化染色顯示，心肌微血管密度降低，提示心肌細(xì)胞在高血糖環(huán)境中受損，證實(shí)了糖尿病心肌微血管病變的存在。與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達(dá)組心肌微血管密度增加，且心臟超聲結(jié)果提示心臟收縮功能好轉(zhuǎn)；而Let-7f-5抑表達(dá)組大鼠心肌微血管密度更加稀疏，心臟收縮功能惡化，說明心肌Let-7f-5p可影響糖尿病心肌微血管病變，最終影響心臟功能。

Let-7/AGO1/VEGF是一條促進(jìn)血管生成的信號(hào)通路。有研究顯示，在缺氧情況下，Let-7可靶向抑制AGO1表達(dá)。AGO1蛋白屬于AGO蛋白家族，在真核細(xì)胞中miRNA與AGO蛋白結(jié)合，最終形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），RISC再通過靶向調(diào)控mRNA，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)性調(diào)控［14］。AGO1蛋白是AGO蛋白家族成員，是調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵蛋白［15-17］。其表達(dá)抑制導(dǎo)致VEGF mRNA表達(dá)上調(diào)，VEGF蛋白表達(dá)增加，從而使血管生成增多［6-7］。CHEN等［7］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞中Let-7a、Let-7f等Let-7家族成員miRNA表達(dá)明顯上調(diào)，VEGF mRNA表達(dá)增加；通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，AGO1可能是中間重要的調(diào)控位點(diǎn)；分別抑制Let-7表達(dá)及過表達(dá)AGO1后均可減弱內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證后，最終發(fā)現(xiàn)Let-7/AGO1/VEGF信號(hào)通路的存在，即當(dāng)上調(diào)Let-7表達(dá)后，AGO1表達(dá)降低而VEGF表達(dá)增加，最終導(dǎo)致血管生成增加。ZHU等［6］發(fā)現(xiàn)，低氧處理的人脂肪來源干細(xì)胞細(xì)胞外囊泡中Let-7f-5p、Let-7a-5p、Let-7i-5p、Let-7c-5p表達(dá)增加，進(jìn)一步阻斷Let-7家族表達(dá)，檢測(cè)AGO1、VEGF mRNA/蛋白的表達(dá)并評(píng)估體外促血管生成能力，最終表明Let-7/AGO1/VEGF信號(hào)通路可調(diào)控血管生成。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，空病毒組心肌AGO1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，VEGF表達(dá)降低，表明AGO1蛋白可能通過參與RISC的形成，調(diào)控VEGF的表達(dá)。與空病毒組比較，Let-7f-5p過表達(dá)組心肌AGO1 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，VEGF mRNA和蛋白表達(dá)升高，而Let-7f-5p抑制表達(dá)組的檢測(cè)結(jié)果相反，AGO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，VEGF mRNA和蛋白水平降低。這表明上調(diào)Let-7f-5p表達(dá)可通過抑制AGO1蛋白表達(dá)從而增加心肌VEGF表達(dá)，增加心肌微血管密度，改善糖尿病大鼠的心臟功能。

綜上所述，Let-7f-5p可能通過Let-7/AGO1/VEGF信號(hào)通路調(diào)控影響糖尿病大鼠心肌微血管病變，其表達(dá)上調(diào)可增加糖尿病心肌微血管密度，改善心臟功能，為糖尿病心肌微血管病變的靶向治療提供了思路和方向。