楊思慧，王錦，黃嬋，安夢(mèng)如，張愛(ài)青，甘衛(wèi)華

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南京210003

慢性腎臟病（CKD）是由多種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)及功能障礙，腎纖維化是其主要病理學(xué)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移等多種生物學(xué)活性，能夠介導(dǎo)腎小球系膜纖維化，是腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)［1-3］。Smad蛋白是TGF-β下游的主要效應(yīng)蛋白，在腎臟受到各種病理性因素（缺血、缺氧或高糖等）和外界環(huán)境誘導(dǎo)因素時(shí)，活化的TGF-β1結(jié)合Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受體以及受體相關(guān)Smad（R-Smad），即Smad2和Smad3；磷酸化的Smad2/3與Smad4形成低聚物，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)纖維化相關(guān)蛋白α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及膠原蛋白（Collagen）形成，進(jìn)一步誘導(dǎo)腎小管上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進(jìn)腎纖維化［4-5］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）雖然不參與編碼蛋白質(zhì)，但可作為重要的調(diào)控分子發(fā)揮多種生物學(xué)功能，在某些細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用［6］。本課題組前期通過(guò)高通量lncRNA微矩陣芯片技術(shù)在TGF-β1處理的系膜細(xì)胞中篩選出lncRNA uc.412，證實(shí)其表達(dá)與系膜細(xì)胞增殖密切相關(guān)，但其在系膜細(xì)胞中的具體生物學(xué)功能尚不明確［7-9］。SIS3是Smad3磷酸化特異性抑制劑，2020年6—11月，本研究采用SIS3抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化，觀察TGF-β1誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞纖維化蛋白表達(dá)的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制與lncRNA uc.412的關(guān)系，為臨床防治腎纖維化相關(guān)的CKD奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。過(guò)表達(dá)慢病毒lncRNA uc.412購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，1型膠原蛋白（Collagen-1）、α-SMA抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，TGF-β1購(gòu)自Novoprotein公司，SIS3購(gòu)自MCE公司，低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，GAPDH購(gòu)自Affinity公司，二抗兔IgG、二抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基生物，TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，PCR引物由上海銳真生物合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HBZY-1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，2～3 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)，加入0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞lncRNA uc.412表達(dá)檢測(cè) 采用Real-time PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按（2～8）×105/孔接種至6孔板，隨機(jī)分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+SIS3組。對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，TGF-β1組加入10 ng/mL TGFβ1，TGF-β1+SIS3組同時(shí)加入10 ng/mL TGF-β1和1μmol/L SIS3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配置10μL PCR反應(yīng)體系，以β-actin作為內(nèi)參，參照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Real-time PCR。引物序列：lncRNA uc.412上游5'-CTTGAATTCCAAGCAGCA?CA-3'，下游5'-CAGCAATTAATCCCCCAAGA-3'；βactin上游5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應(yīng)體系（20μL）：SYBR 5μL，上下游引物各0.4μL，Rox 0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃5 s；退火60℃34 s；延伸60℃1 min，40個(gè)循環(huán)；降溫50℃30 s。通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。細(xì)胞分組與干預(yù)方法同“1.3”。收集各組細(xì)胞，加入蛋自裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，變性處理（95℃，10 min）。取30μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗（稀釋比例為1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次；加入二抗（稀釋比例為1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次。加入ECL發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)圖像掃描，Image J軟件測(cè)定灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 過(guò)表達(dá)lncRNA uc.412對(duì)腎小球系膜細(xì)胞纖維化蛋白表達(dá)的影響觀察

1.5.1 細(xì)胞分組與慢病毒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70%，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。將細(xì)胞分為對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和病毒空載組，過(guò)表達(dá)組加入lncRNA uc.412過(guò)表達(dá)病毒液，病毒空載組加入不含lncRNA uc.412的慢病毒液，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃培養(yǎng)24 h。

1.5.2 細(xì)胞Collagen-1、α-SMA mRNA表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法。PCR引物序列：α-SMA上游5'-AACTATGCTTCTGGACGTACAA-3'，下 游5'-CATAGCCCTCATAGATAGGCAC-3'；Collagen-1上游5'-AAAGATGGACTCAACGGTCTC-3'，下游5'-CAG?GAAGCTGAAGTCATAACCA-3'。具體操作步驟參照“1.3”。

1.5.3 細(xì)胞Collagen-1、α-SMA蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。具體操作步驟參照“1.4”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞lncRNA uc.412表達(dá)比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，TGF-β1組lncRNA uc.412表達(dá)升高；與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組lncRNA uc.412表達(dá)下降（P均<0.01）。

表1 各組細(xì)胞lncRNA uc.412表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組細(xì)胞lncRNA uc.412表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與TGF-β1組相比，#P<0.01。

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2.2 各組細(xì)胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，TGF-β1組細(xì)胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達(dá)升高（P均<0.05）；與TGF-β1組 比 較，TGF-β1+SIS3組 細(xì) 胞Collagen-1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達(dá)下降（P均<0.05）。

表2 各組細(xì)胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組細(xì)胞Collagen 1、α-SMA及p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與TGF-β1組相比，#P<0.05，##P<0.01。

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2.3 過(guò)表達(dá)lncRNA uc.412對(duì)細(xì)胞纖維化蛋白及mRNA的影響 見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，病毒空載組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化（P均>0.05），過(guò)表達(dá)組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)均升高（P均<0.05）。

表3 各組細(xì)胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組細(xì)胞Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組、病毒空載組相比，*P<0.05。

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3 討論

了解腎纖維化的分子發(fā)病機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)CKD的新型治療策略有重要作用。腎臟纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要病理表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)沉積和纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，共同導(dǎo)致腎間質(zhì)、腎小球硬化及慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，引起各種誘因?qū)е碌穆阅I臟疾?。?0］。研究表明，進(jìn)行性腎纖維化是由多種介質(zhì)通過(guò)多種途徑介導(dǎo)的，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、代謝毒素和應(yīng)激分子等，其中TGF-β1是腎臟纖維化的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)。TGF-β1是TGF-β超家族的成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程［11］。本研究結(jié)果顯示，腎小球系膜細(xì)胞中加入TGF-β1處理后，纖維化相關(guān)蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白表達(dá)升高，證實(shí)TGF-β1可以誘導(dǎo)腎小球系膜纖維化。

lncRNA在某些細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，關(guān)于lncRNA與腎臟疾病的研究越來(lái)越多，已有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA參與腎纖維化［12］。FENG等［13］報(bào)道，在輸尿管梗阻性腎病（UUO）和抗腎小球基底膜腎小球性腎炎（抗GBM-GN）小鼠中，發(fā)現(xiàn)151個(gè)Smad3依賴(lài)性的lncRNA，其中Erbb4-IR是通過(guò)下調(diào)Smad7來(lái)導(dǎo)致TGF-β/Smad3介導(dǎo)腎纖維化。WANG等［14］報(bào)道，TGF-β/Smad3相互作用長(zhǎng)非編碼RNA（lnc-TSI）受Smad3轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并特異性抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad3磷酸化和下游纖維化基因表達(dá)，從而阻止Smad3與獨(dú)立于Smad7的TGF-β受體1相互作用，抑制腎臟纖維化。因此，研究lncRNA對(duì)于治療腎纖維化導(dǎo)致的慢性腎臟疾病具有重要意義。lncRNA uc.412基因全長(zhǎng)268 bp，位于人類(lèi)17號(hào)染色體q12片段，其表達(dá)水平與系膜細(xì)胞增殖程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腎小球系膜細(xì)胞加入TGF-β1后，與對(duì)照組相比，TGF-β1組lncRNA uc.412表達(dá)明顯上調(diào)；建立過(guò)表達(dá)lncRNA uc.412的系膜細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組纖維化相關(guān)蛋白Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)均顯著增加。這表明lncRNA uc.412參與介導(dǎo)腎小球系膜纖維化，但TGF-β1通過(guò)lncRNA uc.412調(diào)控系膜纖維化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Smad蛋白家族是TGF-β下游的主要效應(yīng)蛋白，在腎臟受到各種病理性因素（如缺血、缺氧或高糖等）和外界環(huán)境誘導(dǎo)因素影響時(shí)，TGF-β受體被激活，與下游底物Smad蛋白家族結(jié)合，形成復(fù)合體轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步誘導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腎纖維化。其中Smad3是有效的致纖維化因子，敲除Smad3有效減輕腎臟纖 維 化［1］。XU等［15］發(fā) 現(xiàn)，敲 除Smad3可 降 低lncRNA Erbb4-IR轉(zhuǎn)錄，同時(shí)增加miR-29b轉(zhuǎn)錄，保護(hù)小鼠腎臟免受進(jìn)行性腎損傷，Smad3可能成為糖尿病腎病的新型有效治療靶標(biāo)。ZHOU等［16］在Smad3野生型/敲除型的小鼠上構(gòu)建單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎臟纖維化模型，發(fā)現(xiàn)lncRNA np_5318和np_17856參與了TGF-β1介導(dǎo)的腎纖維化，并可能成為腎臟纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。因此推測(cè)，TGF-β1可能通過(guò)與下游Smad3信號(hào)通路上調(diào)lncRNA uc.412，進(jìn)而促進(jìn)系膜細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。SIS3是Smad3的特異性抑制劑，可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化。JI等［17］研究發(fā)現(xiàn)，SIS3通過(guò)抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎臟中的TGF-β/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善了腎組織纖維化、細(xì)胞凋亡及炎癥。本研究結(jié)果顯示，與TGF-β1組比較，TGF-β1+SIS3組p-Smad3水平下調(diào)，證實(shí)SIS3能特異性抑制Smad3磷酸化；用SIS3干預(yù)后，與TGF-β1組相比，TGF-β1+SIS3組Collagen-1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低，證實(shí)TGF-β1通過(guò)Smad3信號(hào)途徑誘導(dǎo)系膜細(xì)胞纖維化蛋白表達(dá)增加；與TGF-β1組相比，TGF-β1+SIS3組系膜細(xì)胞lncRNA uc.412表達(dá)降低，提示TGF-β1可以通過(guò)Smad3信號(hào)通路上調(diào)lncRNA uc.412表達(dá)，從而參與腎小球系膜纖維化的進(jìn)程。

綜上所述，TGF-β1能夠誘導(dǎo)腎小球系膜纖維化，其作用機(jī)制可能是通過(guò)Smad3信號(hào)通路上調(diào)lncRNA uc.412表達(dá)從而發(fā)揮作用，提示lncRNA uc.412可能具有治療CKD的潛在前景，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。