李亮亮， 楊文玲， 杜志敏， 甄 靜， 王繼雯

（河南省科學院生物研究所有限責任公司/河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008）

花生白絹病是枯萎型真菌病害，發(fā)生范圍廣泛，曾對美國［1］、阿根廷［2］、印度［3］、日本［4］等國家的花生產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，該病病原菌的無性世代是齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.），有性世代為羅氏阿太菌（Athelia rolfsii）［5］. 該病菌寄主范圍廣泛，能侵染花生、辣椒、油茶、白術等植物，是一種危害嚴重的土傳真菌［6-9］. 我國各大花生產(chǎn)區(qū)都有白絹病的發(fā)生，尤其以北方地區(qū)危害最為嚴重［10］. 2004年，山東省臨沂市白絹病發(fā)病面積達60 000 hm2，造成直接經(jīng)濟損失9000萬元［11］. 2010年，河南中牟、登封、汝南等花生產(chǎn)區(qū)白絹病大爆發(fā)，有些地塊花生白絹病發(fā)病率高達80%，造成了嚴重的經(jīng)濟損失［12］. 本研究從河南省汝南縣花生病株上分離白絹病的病原菌，對其進行了菌種鑒定，同時研究了病原菌的生物學特性和室內(nèi)抗病高效藥篩選，以期為白絹病的防治研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 病株采集與病原菌的分離

2019年8月在河南省駐馬店市汝南縣花生產(chǎn)區(qū)采集具有白絹病典型癥狀的花生植株，小心收集莖稈基部的菌核帶回實驗室進行病原菌分離. 病原菌的分離采用菌核分離法和組織分離法.

菌核分離法：將收集到的菌核用75%乙醇處理30 s，30%次氯酸鈉處理2 min 進行表面消毒，無菌水沖洗. 將消毒后的菌核放在無菌環(huán)境中自然風干，置于PDA培養(yǎng)基（200 g新鮮馬鈴薯去皮煮汁，葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL）在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至產(chǎn)菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲.

組織分離法：將花生發(fā)病組織的病健交界處切成5 mm長的小段，表面消毒后置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至萌發(fā)產(chǎn)生菌絲.

用無菌牙簽挑取菌落邊緣菌絲重新接種到PDA平板上進行純化.

1.2 病原菌的致病性測定

將通過兩種方法分離到的病原菌（RS-1、RS-2）菌餅無傷接種到盆栽培養(yǎng)2個月的花生植株根基部，外加浸有無菌水的棉球保濕，置于人工氣候箱內(nèi)（溫度25 ℃，濕度60%，16 h光照、8 h黑暗）培養(yǎng). 每個處理接種4株花生，以接種PDA培養(yǎng)基為對照. 每3 d觀察一次發(fā)病情況，20 d后將發(fā)病植株的病部組織帶回實驗室進行病原菌的分離. 將分離純化后的菌株置于PDA平板上培養(yǎng)，觀察分離菌株的菌落形態(tài)、菌核大小，并將菌株RS-1、RS-2進行比較.

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 將病原菌RS-1、RS-2接種到PDA平板上置于25 ℃條件下培養(yǎng). 3 d后，觀察菌落的形狀、顏色及菌絲形態(tài)等. 繼續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察RS-1和RS-2在PDA平板上形成的菌核數(shù)量、顏色變化等，并測量菌核直徑. 經(jīng)致病性驗證和形態(tài)特征觀察，發(fā)現(xiàn)RS-1、RS-2完全一致，是同一種病菌，故采用RS-1為研究對象.

1.3.2 分子生物學鑒定 病原菌RS-1菌株基因組的提取方法如下：將菌株RS-1接種于PDA平板上培養(yǎng)3 d，無菌條件下收集菌絲體，使用真菌基因組提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行提取，將提取的RS-1基因組置于-20 ℃冰箱中備用. 以提取的菌株RS-1的基因組為模板，對病菌的rDNA-ITS序列進行PCR擴增.引物序列：ITS1為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由華大基因測序. 將測序結果在NCBI 網(wǎng)站上進行Blast 比對，選取同源性較高的菌株序列，用MEGA 6.05軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 病原菌生物學特性測定

1.4.1 溫度對病原菌生長及菌核形成的影響 取直徑5 mm的RS-1菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于4、10、15、20、25、30、35、40和45 ℃條件下培養(yǎng). 3 d后，十字交叉法測量不同處理溫度下RS-1的菌落直徑，平均直徑減去5 mm作為實際生長直徑. 繼續(xù)培養(yǎng)10 d，記錄不同溫度下產(chǎn)生的菌核數(shù)量. 每個處理溫度設3個重復.

1.4.2 培養(yǎng)基pH對病原菌生長及菌核形成的影響 用1 mol/L的NaOH和HCl將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至1.0～12.0，然后把病原菌RS-1接種于不同pH的PDA 平板上，在25 ℃條件下培養(yǎng). 按照1.4.1項的方法測量不同pH下菌落生長直徑和產(chǎn)生的菌核數(shù)量.

1.4.3 培養(yǎng)基碳、氮源對病原菌生長及菌核形成的影響 以Czapek培養(yǎng)基（KNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、蒸餾水1000 mL、瓊脂20 g）作為基礎培養(yǎng)基，分別以葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、山梨醇、淀粉、甘露醇等量置換其中的蔗糖作為培養(yǎng)基碳源. 將菌株RS-1菌餅接種于以上不同碳源培養(yǎng)基上置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 菌落生長直徑和產(chǎn)生菌核數(shù)量的測量方法同1.4.1項.

以Czapek培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別以胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、氯化銨、甘氨酸等量置換其中的KNO3作為培養(yǎng)基氮源. 將菌株RS-1菌餅接種于以上不同氮源培養(yǎng)基上置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng). 菌落生長直徑和產(chǎn)生菌核數(shù)量的測量方法同1.4.1.

1.4.4 菌核致死溫度的測定 將菌株RS-1的成熟菌核轉移到裝有無菌水（完全淹沒菌核）的試管中，在45、50、55和60 ℃的水浴鍋中處理10 min后，取出試管在流水下使其迅速冷卻. 隨后取出菌核置于PDA平板上，25 ℃條件下培養(yǎng). 3 d后檢查菌核的萌發(fā)情況，每次檢查不少于30粒菌核. 每個處理做3次重復.

1.5 室內(nèi)藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法測定8種市售藥劑對白絹病菌的室內(nèi)毒力. 藥劑種類、劑型及生產(chǎn)廠家見表1. 用分析天平精確稱取一定量的供試藥劑，并用無菌水配置成10 000 mg/L 的母液. 將母液加入到PDA 培養(yǎng)基（50 ℃左右）中制成含不同藥劑濃度的帶毒平板. 將病原菌RS-1 接種于帶毒平板，置于25 ℃條件下培養(yǎng).每個處理重復3次，以加入無菌水的PDA培養(yǎng)基作對照. 待對照的菌落接近長滿整個平板時，測量各處理的菌落直徑，計算不同藥劑對菌株RS-1的菌絲生長抑制率. 菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100. 根據(jù)抑菌率求出毒力回歸方程y=ax+b，并計算不同藥劑的有效抑制中濃度（EC50）.

表1 8種供試藥劑性狀Tab.1 Properties of eight test fungicides

2 結果與分析

2.1 花生白絹病病害癥狀

花生各個生育期均可受白絹病菌的侵染，以成株期感染最為嚴重，危害部位主要是莖基部、根部以及果柄和莢果. 花生植株感病早期，感病部位由綠色轉變?yōu)楹稚霈F(xiàn)云紋狀斑點，在莖基部和根部土壤表面往往會長出一層白色絹絲狀菌絲體（圖1a）. 隨著病害的加重，感病部位開始出現(xiàn)腐爛、皮層脫落等癥狀，植株葉片邊緣焦枯，最后枯萎而死. 環(huán)境潮濕時，莖基部和附近土壤的菌絲體會形成褐色、油菜籽狀的菌核（圖1b箭頭所示）.

2.2 病原菌致病性驗證

圖1 花生白絹病癥狀圖Fig.1 Symptoms of peanut southern blight

用分離的病菌RS-1、RS-2 接種花生植株3 d 后，花生根基部開始出現(xiàn)少量放射狀白色菌絲體，12 d后菌絲體大量出現(xiàn)，花生根基部出現(xiàn)與田間自然感病植株相似的癥狀，而接種PDA培養(yǎng)基的對照植株沒有任何發(fā)病癥狀. 20 d 后將感病花生植株帶回實驗室進行病原菌分離，將分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 d，獲得了與接種菌株RS-1和RS-2菌落、菌核形態(tài)特征一致的病原菌，完成科赫法則驗證，證明菌株RS-1和RS-2對花生均具有致病性.

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學鑒定 病原菌RS-1和RS-2能在PDA培養(yǎng)基上良好地生長，菌絲為白色細羽毛狀，有隔膜，多分枝，向四周輻射生長（圖2a、b）. 25 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d，即可長滿直徑為90 mm平板. 繼續(xù)培養(yǎng)5～6 d，菌絲體緊密交織在一起開始形成菌核. 菌核初為白色，漸變?yōu)辄S色，最后轉為深褐色（圖2c）. 菌核多為球形，大小不一，表面光滑有光澤，直徑0.4～2.2 mm. 經(jīng)比較，病原菌RS-1和RS-2在對花生的致病性以及形態(tài)特征上完全一致，是同一種病菌. 根據(jù)《真菌鑒定手冊》［13］，初步將汝南縣花生白絹病菌鑒定為齊整小核菌（S.rolfsii）.

圖2 菌株RS-1的菌落、菌絲和菌核形態(tài)Fig.2 Characteristic of colony，mycelium and sclerotia from strain RS-1

2.3.2 分子生物學鑒定 以提取的菌株RS-1的基因組為模板，對病菌的rDNA-ITS序列進行PCR擴增. 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，顯示約600 bp的單一條帶（圖3）. 產(chǎn)物經(jīng)測序，獲得639 bp的rDNA-ITS片段，將序列提交至Genbank，獲得登錄號MN646214. 將獲得的rDNA-ITS 序列與Genbank中的序列進行Blast 比對，結果表明菌株RS-1與羅氏阿太菌（A.rolfsii）有99%的最大相似性. 選取同源性較高的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可以看出菌株RS-1與A.rolfsii聚于同一分支. 綜合菌落形態(tài)特征與分子生物學分析，將菌株RS-1鑒定為羅氏阿太菌（A.rolfsii），其無性態(tài)為齊整小核菌（S.rolfsii）.

圖3 花生白絹病菌RS-1的rDNA-ITS序列電泳圖Fig.3 PCR products of rDNA-ITS of the pathogen RS-1

圖4 花生白絹病菌RS-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the pathogen RS-1

2.4 病原菌生物學特性測定

2.4.1 培養(yǎng)溫度對病原菌生長及菌核形成的影響 不同培養(yǎng)溫度對病原菌生長和菌核形成的影響見圖5.由圖5 可知，在10 ～35 ℃條件下病菌可以正常生長，在溫度為30 ℃時生長速度最快，3 d 后菌落直徑為81.51 mm. 在20～35 ℃條件下病原菌能產(chǎn)生成熟菌核，其中在溫度為25 ℃時產(chǎn)生的菌核最多，達到平均124 粒/皿. 在10 ℃和15 ℃條件下，病菌雖然能生長，但不能產(chǎn)生菌核.

圖5 溫度對病原菌RS-1菌絲生長及菌核形成的影響Fig.5 Effects of temperature on growth and sclerotia formation of S.rolfsii RS-1

2.4.2 培養(yǎng)基pH 對病原菌生長及菌核形成的影響 病原菌RS-1生長的pH 值范圍廣泛，在pH 為2.0～10.0之間均能生長. 培養(yǎng)3 d后，pH為6.0時菌落直徑最大，達到82.81 mm，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后產(chǎn)生的成熟菌核數(shù)量也最多，為132 粒/皿，可將其視為白絹病病原菌生長的最適pH. 在pH值為9.0和10.0時，雖然病原菌能生長，但此時不能產(chǎn)生成熟菌核（圖6），說明堿性環(huán)境會抑制病原菌菌核的產(chǎn)生.

圖6 pH對病原菌RS-1菌絲生長及菌核形成的影響Fig.6 Effects of pH on growth and sclerotia formation of S.rolfsii RS-1

2.4.3 培養(yǎng)基碳、氮源對病原菌生長及菌核形成的影響 不同培養(yǎng)基碳源對病原菌生長和菌核形成的影響如表2. 由表2 可知，供試的7 種碳源均能被白絹病菌利用進行營養(yǎng)生長，其中在以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上生長的最快，3 d 后菌絲生長直徑為81.42 mm，甘露醇次之. 繼續(xù)培養(yǎng)10 d 后，產(chǎn)生的菌核數(shù)量分別為32 粒/皿和48 粒/皿. 在以半乳糖為碳源的培養(yǎng)上，病原菌菌絲生長的速度雖然不是最快，但10 d后卻產(chǎn)生了最多數(shù)量的菌核，達到78 粒/皿. 另外，在以葡萄糖、麥芽糖、淀粉為碳源的培養(yǎng)上病原菌不能產(chǎn)生菌核.

表2 不同碳源對病原菌RS-1菌絲生長及菌核形成的影響Tab.2 Effects of carbon sources on growth and sclerotia formation of S.rolfsii RS-1

不同氮源對病原菌菌絲生長及菌核形成的影響結果見表3. 白絹病菌在以胰蛋白胨為碳源的培養(yǎng)基上生長情況最好，培養(yǎng)3 d后菌絲生長直徑77.06 mm，硫酸銨和硝酸鉀次之. 白絹病菌在以胰蛋白胨為碳源的培養(yǎng)基上形成了最多的菌核，10 d后菌核數(shù)量為62 粒/皿. 病原菌幾乎不能利用尿素為氮源進行營養(yǎng)生長，培養(yǎng)3 d后菌絲生長直徑9.07 mm，并且不能形成菌核.

表3 不同氮源對病原菌RS-1菌絲生長及菌核形成的影響Tab.3 Effects of nitrogen sources on growth and sclerotia formation of S.rolfsii RS-1

2.4.4 菌核致死溫度的測定 實驗結果表明，RS-1菌核經(jīng)45 ℃水浴處理10 min后，菌核能正常萌發(fā)，萌發(fā)率為84%. 溫度升到50 ℃時，菌核萌發(fā)率下降到22%. 菌核經(jīng)55 ℃和60 ℃水浴處理后萌發(fā)率為0. 由此可知，菌核的抑制萌發(fā)溫度為55 ℃，時間為10 min.

2.5 室內(nèi)藥劑毒力測定

實驗用的8種殺菌劑對白絹病病菌的室內(nèi)毒力測定結果見表4. 由表4可知，戊唑醇對白絹病病菌的菌絲生長抑制作用最強，EC50值最小，為0.462 9 mg/L. 其次是氟菌唑和丙森鋅，EC50值分別為12.177 0 mg/L和14.235 0 mg/L. 多菌靈對病菌的抑制作用最差，EC50值最大，為38.128 6 mg/L.

表4 8種藥劑對白絹病菌RS-1的室內(nèi)毒力測定結果Tab.4 Toxicity of eight fungicides towards S.rolfsii RS-1

3 結論與討論

花生白絹病是世界范圍內(nèi)危害嚴重的一種土傳真菌病害，目前還沒有行之有效的防治辦法. 早在20世紀六七十年代，河南省就有花生白絹病發(fā)生的報道，由于當時未造成嚴重危害，所以并未引起人們的重視.近年來，河南開封、駐馬店等花生產(chǎn)區(qū)白絹病危害嚴重，發(fā)病嚴重地塊發(fā)病率可達80%以上，有些地塊甚至顆粒無收. 從河南省汝南縣花生病株上分離到白絹病病原菌RS-1，并通過科赫法則驗證了其致病性. 根據(jù)病菌的形態(tài)特征和rDNA-ITS序列的分析結果，將引起花生白絹病的病原菌RS-1鑒定為羅氏阿太菌（A.rolfsii），其無性態(tài)為齊整小核菌（S.rolfsii）. 這與傅俊范等［14］分離的遼寧花生白絹病的病原菌相一致. 二者對溫度的要求非常接近，菌絲的最適生長溫度均為30 ℃，都在25 ℃時產(chǎn)生最多的菌核. 張翠英［15］對引起云南玄參白絹病的病原菌進行了鑒定，經(jīng)鑒定病原菌同樣為齊整小核菌. 與菌株RS-1相比，二者的生物學特性十分接近，在低于10 ℃的環(huán)境下均不能正常生長，菌絲的最適生長溫度均為30 ℃等. 兩者的菌絲生長范圍稍有不同，花生白絹病病菌的生長范圍為10～35 ℃，玄參白絹病病原菌的生長范圍為13～40 ℃. 生長pH方面，二者的最適pH均為6.0，這也與前人研究的辣椒白絹?。?6］和韭菜白絹病［17］病菌的最適生長pH一致. 白絹病菌隨著培養(yǎng)基pH值增加，生長逐漸變慢，說明病菌喜好酸性土壤環(huán)境，防治該病時可以施用堿性肥料調(diào)節(jié)土壤的酸堿性，達到抑制病菌生長的效果.

花生白絹病對7種供試碳源的利用有較大差異. 在以山梨醇和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上病菌生長速度最快，淀粉、葡萄糖、麥芽糖次之，對半乳糖的利用效果最差. 但是卻在半乳糖培養(yǎng)基上形成了最多數(shù)量的菌核，而在以淀粉、葡萄糖、麥芽糖為培養(yǎng)基碳源時，病菌不能形成菌核，這說明白絹病菌在菌絲生長階段和菌核形成階段所需的碳源有較大不同，在菌核形成階段所需的碳源條件更為苛刻. 花生白絹病在供試的7種氮源上均能生長，對胰蛋白胨的利用效果最好，此時也能產(chǎn)生更多的菌核，說明病菌在菌絲生長階段和菌核形成階段所需的氮源較一致. 病菌在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長非常緩慢，且不能產(chǎn)生菌核，這一結果與前人的報道相一致［18］，這可能與尿素的堿性性質(zhì)有關.

本文研究了8種市售藥劑對白絹病病菌的室內(nèi)毒力效果，結果表明戊唑醇對病菌的抑制效果最好，EC50值最小，為0.462 9 mg/L. 作為一種三唑類甾醇脫甲基抑制劑，戊唑醇具有低毒、殺菌普廣、持效期長的特點，抗真菌活性極高，且對環(huán)境友好，可作為防治白絹病的首選用藥. 氟菌唑、丙森鋅和惡霉靈對白絹病菌也具有較好的抑制效果，可作為備選用藥. 謝瑾卉等［19］研究了9種殺菌劑對花生白絹病的室內(nèi)抑制效果，結果表明三唑類殺菌劑己唑醇EC50值最小，對白絹病菌的毒力最強. 同為三唑類藥劑，戊唑醇和己唑醇對病菌的作用機制均為抑制其細胞膜上麥角甾醇的去甲基化，使得病菌無法形成細胞膜，從而殺死病菌［20］. 在實際生產(chǎn)中，可對以上幾種殺菌劑進行輪換、復配用藥，以達到最佳防治效果.