柯 穎，洪小栩

(1 中國藥科大學，南京 210009；2 國家藥典委員會，北京 100061)

高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法是20世紀60年代初期在經(jīng)典柱色譜基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種分離分析技術(shù)，汲取了氣相色譜(GC)法的發(fā)展經(jīng)驗。與經(jīng)典色譜法相比，HPLC法具有分離效率高、分析時間短、檢測靈敏度高等優(yōu)勢[1]。HPLC法在藥品研發(fā)和質(zhì)量控制等領(lǐng)域應用廣泛，涉及藥品檢驗的各個方面，如藥品鑒別、雜質(zhì)控制、含量測定等。HPLC法首次收載于《中國藥典》1985年版，在藥品質(zhì)控中的應用日益廣泛，目前已成為藥品安全性、有效性控制最重要的檢測方法。

1 基本原理與類型

HPLC法與經(jīng)典液相色譜法有所不同，基本原理是以液體為流動相，在高壓下利用不同組分與固定相和液體流動相的吸附能力、離子交換作用以及分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。根據(jù)保留時間的不同，對樣品各組分進行定性定量分析[2]。典型的高效液相色譜儀一般具備儲液器、高壓泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等主要部件。

HPLC法按照固定相和流動相的相對極性可分為正相色譜(normal phase chromatography)和反向色譜(reversed phase chromatography)。兩者區(qū)別見表1。

表1 正相色譜法與反向色譜法的區(qū)別

另外，為適應不同有機化合物的特性，保證絕大多數(shù)有機化合物的分離分析，裝有不同類型填料的色譜柱與相對應的流動相形成了不同的分離機制。按照分離過程的機制可分為分配色譜(partition chromatography)、吸附色譜(absorption chromatography)、離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)、分子排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)、親和色譜(affinity chromatography,AC)。

2 HPLC法在歷版《中國藥典》的應用

《中國藥典》1985年版首次新增了HPLC法，將其收入附錄。同時，在二部7個品種的含量測定方法中應用了HPLC法，分別為丙酸睪丸素注射液、葉酸、葉酸片、苯丙酸諾龍注射液、黃體酮注射液、維生素D3注射液、醋酸氟輕松軟膏。按品種數(shù)量統(tǒng)計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應用情況見表2和圖1。

表2 歷版《中國藥典》HPLC法收載情況 個

圖1 歷版《中國藥典》HPLC法收載數(shù)量趨勢

從表2和圖1可以看出，從《中國藥典》1985年版到2020年版的發(fā)展可分為4個時期：1985～2000年為起步期，HPLC法應用品種數(shù)目增多但是增長緩慢；2000～2005年為上升期，HPLC法應用品種數(shù)目增長明顯；2005～2015年為快速發(fā)展期，增長最為明顯的是《中國藥典》2010年版；2015～2020年為平穩(wěn)期，HPLC法應用品種數(shù)目增多但是趨于平穩(wěn)。

值得一提的是，在HPLC法的快速發(fā)展期間，《中國藥典》2010年版一部收載品種2165種，采用HPLC法的有1214種，占總數(shù)的56%；二部收載品種2271種，采用HPLC法的有1366種，占總數(shù)的60%。從最新頒布實施的《中國藥典》2020年版來看，一部、二部采用HPLC法的品種分別占總數(shù)的66%和72%。由此可見，當前HPLC法已成為《中國藥典》中最常用的檢測方法。

按檢測項目統(tǒng)計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應用情況見表3、表4和圖2、圖3。

表3 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目中的應用品種數(shù)量 個

表4 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目中的應用品種數(shù)量 個

圖2 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目應用情況

圖3 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目應用情況

自《中國藥典》1985年版收載HPLC法開始，該法最先應用于化學藥品的含量測定，并于《中國藥典》1990年版首次增加了HPLC法用于5種中藥品種含量測定。HPLC法在藥品質(zhì)量控制方面的應用不斷普及，主要用于藥品安全性、有效性的質(zhì)控項目。在化學藥品中，應用最普遍的檢測項目是鑒別、有關(guān)物質(zhì)和含量測定；在中藥中，應用最普遍的檢測項目是鑒別和含量測定；在生物制品中，主要用于蛋白質(zhì)純度測定。

化學藥品除了關(guān)注鑒別和含量測定項目以外，對有關(guān)物質(zhì)的控制也格外注重。有關(guān)物質(zhì)是指能影響藥物純度、降低主成分含量的雜質(zhì)，主要包括生產(chǎn)過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等[3]。基于安全性考慮，有關(guān)物質(zhì)研究是化學藥品質(zhì)量研究的關(guān)鍵項目，HPLC法常用于化學藥品的有關(guān)物質(zhì)含量測定。從圖3可以看出，采用HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)含量的化學藥品品種數(shù)量增長迅速?；瘜W藥品的鑒別試驗也越來越多地采用HPLC法替代紅外測定法。在含量測定方面，HPLC法更是首選的“黃金法”。

中藥材和飲片作為臨床用中成藥和湯劑的原料，其安全性和有效性一直是熱點話題。針對這兩方面的問題，每一版《中國藥典》的修訂，都把工作重點放在進一步加強中藥材和飲片的專屬性鑒別和質(zhì)量控制上。中藥材和飲片所含成分結(jié)構(gòu)多樣復雜，為鑒別和含量測定帶來巨大挑戰(zhàn)，給方法學的建立提出了更嚴格的要求[4]。面對挑戰(zhàn)，HPLC法憑借其穩(wěn)定性和分離的可靠性，為中藥材和飲片鑒別和含量測定提供了技術(shù)手段，成為突破傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制理念、推進質(zhì)量控制現(xiàn)代化的有力工具。

生物制品的質(zhì)量標準主要強調(diào)安全性、有效性和可接受性。由于受到純度的影響，藥效不能充分發(fā)揮，甚至對人體產(chǎn)生毒副作用。因此，生物制品在精制后，要求檢查純度是否符合規(guī)定。過去對生物大分子的分離主要依賴免疫電泳法，但有一定的局限性。HPLC法逐漸被開發(fā)用于生物制品的純度測定，以其重復性好、自動化程度高、檢測限低(達ng或pg級別)、回收率高且不失活等特點，成為生物制品純度分析的重要工具。

經(jīng)過多年的發(fā)展，HPLC法的應用范圍不斷擴大，涉及各個藥品品種領(lǐng)域，主要用于鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢測和含量測定。以往多數(shù)采用薄層色譜法進行藥物鑒別，優(yōu)勢在于使用簡便且成本較低，但是為了尋求更高的準確性，最終被HPLC法替代。采用HPLC法進行含量測定的優(yōu)勢在于分離效率高，可應用于高沸點、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析，從而替代繁瑣的滴定分析法。

3 技術(shù)展望

隨著各國藥品標準的不斷提高，以及對分離純化技術(shù)的不斷探索，使得HPLC法發(fā)展迅速。HPLC法以其高效、準確性好、操作自動化等特點，已經(jīng)普遍運用于藥物分析檢測的各個領(lǐng)域[5]。HPLC法最大的優(yōu)勢在于藥品的定量檢查。目前，HPLC法的發(fā)展主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面，通過革新技術(shù)仍保持其在定量領(lǐng)域的優(yōu)勢，要求降低色譜柱顆粒度、加快色譜分離效率；另一方面，為了克服其在定性領(lǐng)域的劣勢，通過與其他分析技術(shù)聯(lián)用，如質(zhì)譜(MS)、飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)、核磁共振(NMR)等。

3.1 超高效液相色譜法

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)是在HPLC法的理論基礎(chǔ)上，應用了新型小顆粒填料及裝填技術(shù)、超高壓液相色譜泵、低擴散、低交叉污染的自動進樣器以及快速檢測手段等全新技術(shù)。與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比，能獲得更高的柱效，其分離效率、靈敏度和分辨率都有很大的提高。因此，適合于中藥復雜成分的分離分析，在中藥研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

李垚等[6]采用UPLC法測定丹參不同部位中丹參素、原兒茶酸等14種水溶性成分的含量，建立的UPLC法分離度好、靈敏度高，可實現(xiàn)準確定量。陳冉等[7]采用UPLC法測定了鮮川芎和川芎藥材中6種活性成分的含量。郭社民等[8]建立UPLC法，采用Acquity UPLC HSS T3色譜柱，可同時測定參杞通脈膠囊中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。

3.2 高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。其檢測原理是樣品通過液相色譜系統(tǒng)后由色譜柱分離，隨后質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)荷比分開，經(jīng)檢測器后得到色譜圖，分析后可得知色譜峰中所有化學物質(zhì)的相對分子質(zhì)量信息，可用于識別分子結(jié)構(gòu)以及純度的檢查，適用于極性強、揮發(fā)度低、相對分子質(zhì)量大且熱不穩(wěn)定的混合有機物體系[9]。HPLC-MS法的優(yōu)點：高靈敏度、對樣品的選擇性高以及能對多種樣品成分進行定性定量分析[10]。但同時也存在一定的局限性，如復雜樣品基質(zhì)的干擾物會對分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，而基質(zhì)效應很難消除。HPLC-MS的應用非常廣泛，為分子生物學、化合物的表征及鑒定、定量和定性分析、治療藥物監(jiān)測中的自動免疫分析、臨床化學和毒理學等領(lǐng)域提供了一種強有力的檢測手段。

近些年發(fā)展的液相色譜-光譜技術(shù)包括高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-PDA)、高效液相色譜-圓二色(HPLC-CD)、高效液相色譜-核磁共振(HPLC-NMR)等。HPLC-PDA法適用于大多數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)，可同時檢測多個波長，因此可以一次性得到樣品所有組分的信息，十分方便，但是對流動相選擇有一定的限制[11]。鑒于圓二色檢測器的選擇性較高，只對具有旋光活性的物質(zhì)有響應，因此HPLC-CD法在復雜基質(zhì)中手性化合物的分析以及在手性化合物絕對構(gòu)型的測定中有很好的應用前景[12]。例如，采用HPLC-CD法分析甲霜靈的對映體純度[13]。HPLC-NMR法在分析未知雜質(zhì)時，無需純品作對照，且沒有破壞性，充分發(fā)揮了其專屬性強、快速、準確的優(yōu)點，能做到快速分離、結(jié)構(gòu)鑒定并且對樣品進行定性定量分析。

4 小結(jié)

HPLC法在《中國藥典》中應用范圍不斷擴大，充分說明了該法在藥品檢測領(lǐng)域的重要地位。在《中國藥典》一部(中藥)部分，HPLC法主要用于特征圖譜的定性分析、指紋圖譜的半定量分析以及多成分的含量測定。在《中國藥典》二部(化學藥品)部分，HPLC法主要用于鑒別、有關(guān)物質(zhì)與含量測定，對于復雜樣品體系，必要時采用固相萃取柱進行前處理和富集。在《中國藥典》三部(生物制品)部分，HPLC法主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和純度分析。

現(xiàn)代HPLC法的發(fā)展將在技術(shù)革新、發(fā)展檢測器、創(chuàng)新色譜填料技術(shù)、完善理論等方面做出努力，促使HPLC法及其相關(guān)方法在各個領(lǐng)域的應用范圍不斷擴大，進一步穩(wěn)固HPLC法的主流分析地位，具有廣闊的發(fā)展前景。