田 冰 樊安蓮 劉 璟

(1.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院感染科 重慶 404000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部免疫教研室重慶 404000)

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， M T B）感染造成，近年結(jié)核罹患率上升，結(jié)核患者年輕化，結(jié)核治療難度加大[1]。研究證實(shí)，結(jié)核病的病程與患者體內(nèi)Th細(xì)胞漂移關(guān)系密切，結(jié)核病本身是感染、抗感染免疫和超敏反應(yīng)的三位一體，其組織損傷多由病理性免疫反應(yīng)造成，而臨床治療主要使用國(guó)標(biāo)抗結(jié)核配伍，對(duì)免疫調(diào)節(jié)重視不足。目前國(guó)內(nèi)有不少中藥干預(yù)結(jié)核免疫的研究，如貓爪草、狼毒大戟等[2][3]，因中藥干預(yù)具免疫調(diào)節(jié)機(jī)制而備受重視，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展較少，缺乏相關(guān)經(jīng)驗(yàn)可借鑒。板藍(lán)根多糖是中藥板藍(lán)根提純的多糖成分，近年研究顯示其在感染、腫瘤等疾病中有突出的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[4][5]，故而本研究選定板藍(lán)根多糖為干預(yù)藥物。本研究建立結(jié)核大鼠模型，以癥狀評(píng)估及相應(yīng)檢查為標(biāo)準(zhǔn)，探討板藍(lán)根多糖應(yīng)用于結(jié)核治療的可行性。研究情況介紹如下。

一、資料和方法

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ唾Y料

健康SPF級(jí)大鼠60只，體重200（±20）克，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(川)2013-24，各組間體重和性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10只為對(duì)照組，50只大鼠經(jīng)尾靜脈接種標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV混懸液建造動(dòng)物模型。

1.造模方法

參考呂艷文獻(xiàn)[6]，將經(jīng)大鼠體內(nèi)接種毒力復(fù)蘇的菌種轉(zhuǎn)種改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20天，取干菌落加滅菌生理鹽水研磨成菌懸液，比濁法測(cè)定菌懸液濃度為3×107/ml，經(jīng)尾靜脈注射0.2ml菌懸液，接種前后常規(guī)喂養(yǎng)。

2.造模評(píng)估

根據(jù)盧振方等研究經(jīng)驗(yàn)[7][8]，接種菌株后主要根據(jù)兩方面情況評(píng)判造模結(jié)果：大鼠臨床表現(xiàn)：1.臨床癥狀：毛發(fā)脫落、進(jìn)食減少、體重減輕、精神萎靡、活動(dòng)度降低等；2.實(shí)驗(yàn)室檢查：肺泡灌洗液查結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性。

3.動(dòng)物模型分組、干預(yù)處理及干預(yù)效果評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)造模標(biāo)準(zhǔn)判定造模成功40只，隨機(jī)選其中10只設(shè)定為模型組，其余30只為干預(yù)組。干預(yù)組大鼠確認(rèn)造模成功后分別予板藍(lán)根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d腹腔注射，觀察三組大鼠臨床表現(xiàn)，根據(jù)大鼠癥狀表現(xiàn)及造模評(píng)判，干預(yù)效果評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下：進(jìn)食（＞50g/d為正常，30～40/d為減弱，＜30g/d為嚴(yán)重。），精神狀態(tài)（精神好，對(duì)刺激反應(yīng)敏捷為正常，精神稍差，對(duì)刺激有反應(yīng)為減弱，精神萎靡，刺激反應(yīng)遲鈍為嚴(yán)重），毛發(fā)情況（茂密無(wú)脫落為正常，少量脫落為減弱，大量脫落為嚴(yán)重），體重（變化＜5%為正常，5%＜變化＜10%為減弱，變化＞10%為嚴(yán)重），正常3分、減弱2分、嚴(yán)重1分，采取分?jǐn)?shù)疊加制，10-12分為顯效，6-9分為有效，3-5分為無(wú)效。造模成功后20天和30天各抽一次大鼠外周血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th細(xì)胞亞群表型，ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4、IL-10。

（二）菌種、試劑及藥品

結(jié)核分枝桿菌H37RV菌種由中國(guó)疾控中心重慶結(jié)核病預(yù)防控制分中心提供，-80℃低溫保存，常規(guī)傳代。ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美科技有限公司，IFN-γ試劑盒（CSB-E04579r），IL-4試劑盒（CSB-E04634m），IL-10(CSB-E07451r)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)低溫保存并使用。板藍(lán)根多糖由重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?？鼓[瘤天然藥物研究工程中心自行提取，純度為85%。超低溫冰箱（海爾，DW-86L286)，電子天平（上海越平FA1004B），生物安全柜（蘇州安泰，BSC-1000ⅡA2），酶標(biāo)儀（芬蘭，Multiskan MK3），流式細(xì)胞儀為貝克曼庫(kù)爾特臨床分析型三激光流式細(xì)胞儀DXFlex，顯微鏡用奧林巴斯顯微鏡CX31-LV320。

（三）大鼠肺指數(shù)測(cè)算

肺指數(shù)可表現(xiàn)出肺部炎癥情況的嚴(yán)重程度，三組大鼠處死后，取出肺臟進(jìn)行稱重，按肺指數(shù)計(jì)算公式，肺指數(shù)=肺重量（g）×100/體重（g），計(jì)算得三組大鼠肺指數(shù)并進(jìn)行比較。

（四）數(shù)據(jù)處理

癥狀比較用例數(shù)表示，肺指數(shù)、T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，干預(yù)組大鼠癥狀表現(xiàn)用卡方檢驗(yàn)，肺指數(shù)比較用單因素方差分析，干預(yù)組肺指數(shù)組間比較用兩兩比較，T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果各組間數(shù)據(jù)比較用析因分析，析因設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)組間差異性仍然要用方差分析，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)處理用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0。

二、結(jié)果

（一）三組大鼠癥狀表現(xiàn)

接種菌株之后，模型組和干預(yù)組大鼠于第8天左右出現(xiàn)毛發(fā)脫落、沒(méi)有光澤，進(jìn)食減少、體重減輕，活動(dòng)度降低、精神狀態(tài)差、給予刺激反應(yīng)也比較慢。干預(yù)組大鼠經(jīng)板藍(lán)根多糖干預(yù)后，第20天和第30天測(cè)體重基本未再減輕，進(jìn)食如常，毛發(fā)不再脫落，精神好，給予刺激反應(yīng)正常。期間沒(méi)有大鼠死亡。干預(yù)組大鼠模型中癥狀表現(xiàn)具體情況為300mg.kg.d組顯效4例，有效6例，無(wú)無(wú)效案例，200mg.kg.d組顯效4例，有效6例，無(wú)無(wú)效案例，100mg.kg.d組顯效2例，有效8例，無(wú)無(wú)效案例。期間觀察干預(yù)組大鼠治療效果與干預(yù)劑量正相關(guān)（P＜0.01）。

（二）三組大鼠肺重量指數(shù)比較

三組大鼠處死后，取出肺臟進(jìn)行稱重，按公式計(jì)算得三組大鼠肺指數(shù)及比較情況，健康組大鼠肺指數(shù)為0.55±0.13，模型組大鼠肺指數(shù)3.59±1.12，100mg.kg.d組肺指數(shù)2.67±1.06，200mg.kg.d組肺指數(shù)2.14±0.72，200mg.kg.d組肺指數(shù)1.93±0.69，與健康對(duì)照組相比，干預(yù)組大鼠肺指數(shù)仍有升高，P＞0.05；與模型組相比，干預(yù)組大鼠肺指數(shù)明顯降低P＜0.01；隨給藥劑量，干預(yù)組肺指數(shù)有所降低，組間兩兩對(duì)比，肺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。

（三）三組大鼠Th細(xì)胞表型及表達(dá)情況檢測(cè)

三組大鼠外周血檢查，對(duì)照組CD4 37.12±5.86，CD8 18.43±2.24，CD4/CD8 2.11±0.45；模型組CD4 20.27±5.08，CD8 21.45±2.46，CD4/CD8 1.13±0.31；經(jīng)干預(yù)后，100mg.kg.d組CD4 32.69±6.23，CD8 19.59±2.22，CD4/CD8 1.72±0.22，200mg.kg.d組CD4 36.07±5.14，CD8 19.08±2.23，CD4/CD8 1.89±0.28，300mg.kg.d組CD4 36.42±5.22，CD8 18.82±2.34，CD4/CD8 1.94±0.29，干預(yù)組大鼠檢測(cè)Th細(xì)胞亞群接近健康對(duì)照組，與模型組和對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

（四）三組大鼠細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

干預(yù)組大鼠在造模成功20天開(kāi)始出現(xiàn)IFN-γ、IL-10輕微降低，IL-4未明顯降低，造模成功30天后，干預(yù)組大鼠外周血IFN-γ、IL-10明顯降低，IL-4輕微降低，與模型組及對(duì)照組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），數(shù)據(jù)如下表1。

表1 三組大鼠細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

表1 三組大鼠細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/ml）

lFN-γ lL-4 lL-10對(duì)照組101.57±5.33 50.16±4.82 31.96±4.39 20天61.15±4.88 75.31±6.07 80.84±5.71模型組30天61.37±4.92 75.42±6.21 81.97±5.44 20天81.79±5.62*69.67±5.99**50.16±5.77***100mg.kg.d組30天82.73±5.31*64.72±6.02**52.85±4.98***20天90.64±5.16*67.54±6.19**42.32±5.41***200mg.kg.d組30天95.13±5.67*63.49±6.18**41.56±4.62***20天96.67±5.17*66.69±6.18**40.73±5.33***300mg.kg.d組30天100.73±4.99*61.74±5.78**39.79±4.72***F 241.27 58.58 594.78 P 0.001 0.001 0.001

*F值59.35，P＜0.001，**F值8.33，P＜0.001，***F值30.30，P＜0.001。這三組數(shù)據(jù)的比較反映出板藍(lán)根多糖干預(yù)效果與板藍(lán)根多糖用量正相關(guān)。

（五）三組大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果

造模30天后處死大鼠，模型組大鼠病灶在鏡下可見(jiàn)肺部基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，有干酪樣壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，較多郎罕氏巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞，有典型結(jié)核結(jié)節(jié)；干預(yù)組大鼠鏡下觀肺部基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)損傷較小，炎性浸潤(rùn)較輕，上皮樣細(xì)胞減少而纖維母細(xì)胞增多。

三、討論

結(jié)核病傳播方式多樣，侵犯部位多樣，可通過(guò)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的脂類(lèi)和蛋白類(lèi)物質(zhì)引起機(jī)體超敏反應(yīng)，在結(jié)核病的病程中，感染、免疫和超敏反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的共同作用而又相互影響的整體效應(yīng)。結(jié)核病的病理?yè)p傷也多因超敏反應(yīng)及炎癥損傷所致。研究證實(shí)，結(jié)核病病程與Th細(xì)胞漂移及Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子密切相關(guān)。在近年來(lái)的研究中，板藍(lán)根多糖在感染、腫瘤等疾病中有突出的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，故而選定為干預(yù)藥物。鑒于此前研究缺少相關(guān)經(jīng)驗(yàn)可借鑒，本研究大部分評(píng)估為根據(jù)治療經(jīng)驗(yàn)自行設(shè)置。

研究參照前人研究建立大鼠結(jié)核模型，以癥狀和影像學(xué)檢查為造模判定標(biāo)準(zhǔn)，并設(shè)置癥狀表現(xiàn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。接種菌株后，大鼠于第8天左右開(kāi)始出現(xiàn)不同程度進(jìn)食、體重、精神狀態(tài)的變化，結(jié)合預(yù)設(shè)判定標(biāo)準(zhǔn)，成功造模40只，成功率為80%。干預(yù)組大鼠確認(rèn)造模成功后隨機(jī)分三組，分別予板藍(lán)根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d治療。在進(jìn)行板藍(lán)根多糖干預(yù)后20天左右，干預(yù)組大鼠體重逐漸穩(wěn)定，精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)。繼續(xù)觀察至30天，根據(jù)預(yù)設(shè)癥狀評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，板藍(lán)根多糖干預(yù)組大鼠癥狀較模型組大鼠緩解。病理檢查顯示，未經(jīng)處理的模型組大鼠肺部基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)干酪樣壞死和大量上皮樣細(xì)胞、郎罕氏巨細(xì)胞，為典型結(jié)核結(jié)節(jié)，而經(jīng)板藍(lán)根多糖干預(yù)的大鼠肺部基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)尚存在，炎性浸潤(rùn)較輕，上皮樣細(xì)胞少而纖維母細(xì)胞多，顯示病灶有纖維化趨勢(shì)。結(jié)合癥狀表現(xiàn)評(píng)估和病理檢查，說(shuō)明板藍(lán)根多糖在結(jié)核大鼠模型中可干預(yù)過(guò)度的炎癥病程，減少肺組織炎性病理?yè)p傷，對(duì)結(jié)核干預(yù)有積極作用。

臟器感染MTB后，由于MTB的病理性炎癥反應(yīng)，臟器重量會(huì)增加，其重量與病理變化正相關(guān)。研究結(jié)果表明，在進(jìn)行板藍(lán)根多糖干預(yù)后，干預(yù)組大鼠肺重量指數(shù)較模型組大鼠小，雖然未恢復(fù)至正常，但已說(shuō)明板藍(lán)根多糖對(duì)MTB感染大鼠的病程有積極作用。

多數(shù)研究認(rèn)為，結(jié)核免疫病程與Th細(xì)胞活化失衡及Th細(xì)胞漂移有關(guān)。Th細(xì)胞是人體免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的主力，主要靠分泌細(xì)胞因子發(fā)揮作用。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，具活化巨噬細(xì)胞功能，可調(diào)節(jié)炎癥免疫效應(yīng)，是機(jī)體抗結(jié)核免疫中的關(guān)鍵因子。在既往研究中，證實(shí)由于Th細(xì)胞漂移，外周血IFN-γ在結(jié)核不同的病程期有不同的濃度，其濃度與活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌數(shù)量有關(guān)。在本研究中，造模成功后，外周血CD4Th細(xì)胞降低，CD8T細(xì)胞輕微升高，CD4/CD8出現(xiàn)比例失衡，IFN-γ表達(dá)隨之降低，符合前人研究。使用板藍(lán)根多糖干預(yù)后，CD4Th細(xì)胞逐漸上升，CD8T逐漸接近健康對(duì)照組水平，CD4/CD8隨之接近正常組，IFN-γ逐漸上升，其升高程度與干預(yù)藥量正相關(guān)，結(jié)合癥狀評(píng)估結(jié)果，應(yīng)當(dāng)是板藍(lán)根多糖干預(yù)了Th細(xì)胞的表型分化，恢復(fù)細(xì)胞免疫平衡，IFN-γ表達(dá)逐漸正常，促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗MTB，使結(jié)核病程得到控制，活動(dòng)性MTB減少。IL-4、IL-10主要由Th2細(xì)胞分泌，可調(diào)節(jié)IFN-γ分泌和效應(yīng)，避免結(jié)核病程中過(guò)度炎癥反應(yīng)造成的病理?yè)p傷，在結(jié)核病中具免疫保護(hù)作用。過(guò)低的IL-4被認(rèn)為是結(jié)核嚴(yán)重炎癥病理?yè)p傷的原因。在本研究中，干預(yù)組大鼠的IL-4、IL10在造模成功及造模成功后20天升高，在經(jīng)干預(yù)后30天降低至接近正常水平，結(jié)合大鼠模型的癥狀表現(xiàn)和病理檢查，可以認(rèn)為在此次干預(yù)中，CD4/CD8保持在一個(gè)較合適的動(dòng)態(tài)平衡中，既有利于結(jié)核的抗感染免疫，也可以起到避免病理?yè)p傷的作用。

四、結(jié)束語(yǔ)

板藍(lán)根多糖可通過(guò)對(duì)Th細(xì)胞表型及細(xì)胞因子表達(dá)的影響，對(duì)結(jié)核病程進(jìn)行免疫干預(yù)，減輕病程中病理性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗MTB作用，對(duì)結(jié)核病具積極作用。目前存在的問(wèn)題是：板藍(lán)根多糖在抗MTB的過(guò)程中是否具有量效關(guān)系還不夠明確；板藍(lán)根多糖與其他抗MTB的藥物單獨(dú)作用效果比較和協(xié)同作用效果尚未驗(yàn)證，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。