陶 濤

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004）

肺癌的發(fā)生可受到多種因素的影響，其發(fā)病機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染、長時間接觸致癌物等都是引發(fā)肺癌的重要原因[1]。近年來，人參皂苷Rg3 和蘇拉明被廣泛地應(yīng)用于肺癌的治療中。本次研究主要是分析聯(lián)用人參皂苷Rg3 和蘇拉明對Lewis 肺癌小鼠進行治療對其移植瘤的抑制作用及相關(guān)基因表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象是40 只小鼠，包括4 只Lewis 肺癌荷瘤小鼠和36 只C57BL/6 雌性小鼠。這些小鼠的平均鼠齡為（4.1±0.5）周，平均的體質(zhì)量為（17.05±2.05）g。這些小鼠均購自于醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

1.2 研究方法

本次實驗使用的藥物是人參皂苷Rg3 和蘇拉明。人參皂苷Rg3 購自于成都曼斯特生物公司，蘇拉明購自于美國Sigma 公司。對研究對象中的4 只荷瘤小鼠進行腫瘤接種。在接種后的2 周，提取移植瘤組織，嚴格遵循無菌操作的原則處死小鼠。剝離移植瘤，取1 g 的腫瘤組織作為標(biāo)本，放到4 mL 的生理鹽水勻漿器中進行研磨，經(jīng)組織勻漿液過360 目鋼網(wǎng)得到單細胞懸液。取出腫瘤組織標(biāo)本，在顯微鏡下觀察腫瘤細胞的數(shù)量。在腫瘤組織標(biāo)本中加入適量的生理鹽水，以確保腫瘤細胞的密度達到2×106個/mL。取0.2 mL的懸液注射到C57BL/6 小鼠右側(cè)大腿的內(nèi)側(cè)，建立移植瘤小鼠模型。接種腫瘤的36 只C57BL/6 小鼠均成瘤。在腫瘤接種的第4 天，將36 只C57BL/6 小鼠分為對照組、人參皂苷Rg3 組、蘇拉明組、聯(lián)合組，每組各有9 只小鼠。在對照組小鼠的腹腔內(nèi)注射0.2 mL 的生理鹽水，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在人參皂苷Rg3 組小鼠的胃內(nèi)灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人參皂苷Rg3 的藥液，在其腹腔內(nèi)注射0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在蘇拉明組小鼠的腹腔內(nèi)注射0.2 mL、含10 mg/kg 蘇拉明的藥液，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL 的生理鹽水，1 次/d。在聯(lián)合組小鼠的腹腔內(nèi)灌注0.2 mL、含10 mg/kg 蘇拉明的藥液，在其胃內(nèi)灌注0.2 mL、含5 mg/kg 人參皂苷Rg3 的藥液，1 次/d。對四組小鼠均給藥15 d。

1.3 觀察指標(biāo)及抑制腫瘤效果的評定標(biāo)準(zhǔn)

1）治療后，采用原位末端凋亡法（TUNEL）進行細胞凋亡檢測，嚴格參照檢測說明書進行操作。將已知的陽性切片作為參照。陽性細胞（腫瘤細胞）的評定標(biāo)準(zhǔn)是：在細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。選擇陽性細胞分布密集的區(qū)域。統(tǒng)計每個切片中10 個高倍視野中陽性細胞及正常細胞的總數(shù)。若腫瘤細胞凋亡，可判定抑制腫瘤有效。抑瘤率= 抑制腫瘤有效的小鼠數(shù)/ 小鼠的總數(shù)×100%。2）取出移植瘤后，對腫瘤進行稱重，記錄腫瘤的質(zhì)量。3）對四組小鼠的腫瘤組織切片進行染色，選擇4 個視野，在高倍視野范圍內(nèi)統(tǒng)計染色腫瘤微血管的數(shù)量，取其均值作為切片中腫瘤微血管密度（MVD）值。4）采用RT-PCR 法測定四組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量，采用蛋白質(zhì)印跡法測定其腫瘤細胞中MEK1/2 蛋白的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

對本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用±s表示，用t檢驗，計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較

人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠移植瘤的質(zhì)量均小于對照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3組小鼠、蘇拉明組小鼠移植瘤的質(zhì)量均大于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠的抑瘤率均高于對照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠的抑瘤率均低于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠的MVD 值均小于對照組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠的MVD 值均大于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。詳見表1。其中，對照組小鼠和聯(lián)合組小鼠MVD 值的表達情況見圖A 和圖B。

2.2 四組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2mRNA 的相對表達量及MEK1/2 蛋白表達量的比較

對照組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量高于人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量均高于聯(lián)合組小鼠，P＜0.05。對照組小鼠、人參皂苷Rg3 組小鼠、蘇拉明組小鼠、聯(lián)合組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 蛋白的表達量相比，P＞0.05。詳見表2。

表1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較（± s）

表1 四組小鼠移植瘤的質(zhì)量、抑瘤率、MVD 值的比較（± s）

注：* 表示與對照組小鼠相比，P ＜0.05；&表示與聯(lián)合組小鼠相比，P ＜0.05。

MVD 值（條/0.732 mm2）對照組 9 5.58±2.15& 0& 24.15±3.68&人參皂苷Rg3 組 9 3.61±1.08*& 35.26±5.08&* 13.24±2.18*&蘇拉明組 9 3.59±1.04*& 35.26±5.57&* 12.35±2.04*&聯(lián)合組 9 2.81±0.35* 49.68±5.47* 6.15±2.07*組別 例數(shù) 移植瘤的質(zhì)量（g）抑瘤率（%）

注：圖A 為對照組小鼠移植瘤的MVD 圖，圖B 為聯(lián)合組小鼠移植瘤的MVD 圖

表2 四組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量及MEK1/2 蛋白表達量的比較（%，± s）

表2 四組小鼠腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量及MEK1/2 蛋白表達量的比較（%，± s）

對照組（n=9） 人參皂苷Rg3 組（n=9） 蘇拉明組小鼠（n=9） 聯(lián)合組（n=9）MEK1/2 mRNA 的相對表達量 71.25±15.26 45.26±10.36 43.15±8.34 28.67±5.19 MEK1/2 蛋白的表達量 0.32±0.14 0.33±0.11 0.35±0.14 0.33±0.05

3 討論

肺癌患者腫瘤內(nèi)的血管較為豐富，生長速度較快，導(dǎo)致多數(shù)晚期肺癌患者失去了進行手術(shù)的最佳時機[2]。對于不同分型的肺癌患者，需要采用不同的靶向藥物進行治療。腫瘤細胞易出現(xiàn)耐藥性，較易出現(xiàn)基因突變的情況。部分靶向藥物僅對某個基因突變的腫瘤細胞有效，且單一用藥的效果有限[3]。人參皂苷Rg3 是人參中的有效活性成分。對于心腦血管疾病、四肢乏力、腿腳不便、記憶力減退等中老年人常見疾病都有很好的治療效果。近年來，臨床上常用人參皂苷Rg3 對惡性腫瘤患者進行治療，以抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移。在不同分型的人參皂苷中，人參皂苷Rg3 的調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤作用最為顯著。蘇拉明屬于尿素衍生物，是近年來臨床應(yīng)用范圍較廣的一種抗腫瘤藥。聯(lián)用蘇拉明和人參皂苷Rg3 治療肺癌的效果有待臨床上的進一步研究[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成。MVD 與腫瘤的侵襲性有關(guān)，是預(yù)測癌細胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后的可靠指標(biāo)[5]。本次研究的結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，聯(lián)合組小鼠的MVD 值更小。這說明，將人參皂苷Rg3和蘇拉明聯(lián)合應(yīng)用，可發(fā)揮較為明顯的抑制移植瘤作用。

本次研究的結(jié)果證實，聯(lián)用人參皂苷Rg3 和蘇拉明對Lewis 肺癌小鼠進行治療，可明顯抑制其移植瘤的生長，并可降低其腫瘤細胞中MEK1/2 mRNA 的相對表達量。