李彪 張小梅 王小小 曾芳 何蕓 關信民 趙強*

β3腎上腺素能受體（β3?adrenergic receptor，β3?AR）屬于G 蛋白偶聯受體（G protein?coupled recep?tors，GPCRs）超家族［1］。研究證實，與抑制型G 蛋白（inhibitory G protein，Gi）偶聯的β3?AR 參與了心力衰竭（Heart Failure，HF）的心室重構和心室功能下降［2?4］。心臟β3?AR 途徑的激活可能為調節(jié)心臟重構提供未來的治療途徑［5］。β3?AR 的激活減少了急性心肌梗死大鼠發(fā)生室性心動過速或心室顫動 的 風 險［6］。Salie 等［7］發(fā) 現 對 于 缺 血 的 大 鼠，BRL37344 對β3?AR 的激活具有明顯的心臟保護作用。本研究通過建立大鼠心肌梗死動物模型，初步探討梗死心肌中β3?AR 表達的變化，及β3?AR 是否對梗死心肌起保護作用，從而為β3?AR 在心肌梗死中的作用提供進一步研究的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究已通過廣州市紅十字會醫(yī)院動物實驗倫理審查。（1）動物：SD 大鼠由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，SPF 級，雄性，體重220-240 g，實驗期間籠養(yǎng)于暨南大學實驗動物中心；（2）主要試劑：BRL.37344，SR59230A 美國Sigma 公司產品：（3）實驗儀器：PCR 儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，中國），水平電泳儀、紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司，中國）。

1.2 方法 （1）動物模型制作及分組：Wistar 大鼠隨機分為假手術組（sham?operated group，Sham 組，n=6）和模型組（n=12）。采用結扎左前降支（LAD）法建立大鼠心肌梗死模型［2］。飼養(yǎng)12 周后，Sham組大鼠全部存活，模型組大鼠死亡1 只。11 只大鼠再分為MI 組（n=5）和MI+BRL 組（n=6）。MI+BRL 組大鼠經尾靜脈注射BRL?37344［0.4 nmol/（kg.min）］，每次持續(xù)10 min，每周2 次，共4 周；Sham 組及MI 組大鼠經尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。術后手術組（n=30）大鼠隨機分為MI 組、MI+BRL 組、MI+SR 組。MI+BRL 組 大 鼠 予 以 尾 靜脈注射β3?AR 特異性激動劑BRL?37344［4 nmol/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］，MI+SR 組大鼠予以尾靜脈注射β3?AR 特異性拮抗劑SR59230A［0.56 mg/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］，另外Sham 組及MI 組同時予以尾靜脈注射等量生理鹽水［4 nmol/（kg.min），10 min，3 次/周，共3 周］。（2）采用超聲心動圖檢測心臟參數。（3）HE 染色及免疫組化：過量烏拉坦處死大鼠后，開胸取出心臟，小心分離出左心室。左心室組織4%多聚甲醛固定24 h。取出標本，流水沖洗15 min，切取合適大小組織塊（厚度約0.2 cm）。乙醇、二甲苯脫水和透明后，石蠟包埋并切片。標本進行HE 染色和鏡檢。標本經脫蠟、水化、抗原修復后，分別滴加p?p38 MAPK 一抗和二抗孵育，經DAB 顯色和復染后，脫水、透明、封固、鏡檢。（4）逆轉錄聚合酶鏈式反 應（reverse transcription?polymerase chain reac?tion，RT?PCR）：采用二步法RT?PCR 測定大鼠左心室β3?AR mRNA 表達。β3?AR（444 bp）引物設計參照既往試驗方法［3］。引物序列：上游5′?AGT GGG ACT CCT CGT AAT G?3′，下游5?CGC TTA GCT ACG ACG AAC?3′。以β?actin（187 bp）作為內參照，引物序列為：上游5?GAC AAC GGC TCC GGC ATG TG?3，下游5′?TGA GGA TGC CTC TCT TGC?3′。cD?NA 擴增經94℃3 min，40 個循環(huán)（94℃45 s，60℃45 s，72℃60 s），72℃10 min。取7 μl PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)分析、計算mRNA 表達的強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較經方差齊性檢驗，用單因素方差分析，兩兩多重比較使用Bonferroni t 檢驗（方差齊）或Tamhane's T2 檢驗（方差不齊）。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 四組大鼠超聲心動圖指標比較 見表1。

2.2 四組大鼠Masson 染色結果 與MI 組比較，MI+BRL 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化明顯減輕，MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化面積無顯著變化；MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)心肌纖維化較MI+BRL 組明顯加重；詳見圖1。

表1 心肌梗死后四組大鼠心臟超聲心動圖指標比較

2.3 四組大鼠TUNEL 染色結果 Sham 組比較，MI 組心肌梗死區(qū)心肌細胞凋亡為28.336±2.33%，大鼠心肌梗死區(qū)心肌細胞凋亡水平明顯加重（P＜0.05）；MI+BRL 組大鼠梗死區(qū)心肌細胞的凋亡水平較MI 組顯著減輕（16.236±1.76%vs. 28.336±2.33%，P＜0.05）；MI+SR 組與MI 組未見明顯差別（32.436±1.37% vs. 28.336±2.33%，P＞0.05）；見圖1。MI+BRL 組左心室梗死面積比MI 組及MI+SR 組明顯減少（P＜0.05），且MI 組和MI+SR 組未見明顯差異（P＞0.05）；詳見圖2。

圖1 （電子顯微鏡×200）表示大鼠心肌梗死3 周后心肌梗死區(qū)組織纖維化Masson 圖像，其中紅色表示正常心肌細胞，藍色表示心梗后纖維化

圖2 為心肌梗死面積定量分析圖

2.4 四組大鼠梗死心肌mRNA 表達的比較 與Sham 組比較，MI 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA表達顯著增加（1.690±0.012 vs. 1.162±0.099，P＜0.05）；與MI 組比較，MI+BRL 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達進一步增加（2.135±0.0235 vs.1.690±0.012，P＜0.05），MI+SR 組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達無顯著變化（1.630±0.155 vs.1.690±0.012，P＞0.05）；與MI+BRL 組比較，MI+SR組大鼠心肌梗死區(qū)β3?AR mRNA 表達顯著下降（1.630±0.155 vs.2.135±0.0235，P＜0.05）；詳見圖3。

圖3 各組大鼠β3?AR mRNA 相對表達量（2?ΔΔCT）比較

3 討 論

本研究發(fā)現心肌梗死大鼠模型中梗死區(qū)心肌中β3?AR 表達顯著上調；激動β3?AR 可使心肌纖維化和心肌凋亡程度減輕，提示β3?AR 可能對心肌梗死心臟有保護作用。β3?AR 參與了CHF 的心室重構和心功能的調節(jié)［2?4］。Niu 等［8］用大鼠LAD建立MI 模型，與假手術組比較，MI 大鼠心肌β3?AR 和Gi 蛋白表達水平顯著增加。本研究結果顯示：通過結扎LAD 建立MI 模型，然后對梗死區(qū)的心肌進行β3?AR RT?qPCR 檢測，發(fā)現MI 后心肌β3?AR mRNA 的表達上調；且還發(fā)現β3?AR 激動劑可使MI 心臟血流動力學改善，同時MI 心肌β3?AR mRNA 表 達 量 進 一 步 增 加，β3?AR 拮 抗劑對β3?AR mRNA 表達量無明顯影響。與之相對應的是，MI 心肌凋亡及纖維化水平較對照組升高，β3?AR 激動劑可使MI 心肌的凋亡及纖維化程度降低，β3?AR 拮抗劑則對凋亡及纖維化水平無明顯影響，提示MI 后β3?AR 表達上調可能對梗死心肌具有保護作用。García 研究表明［9］，再灌注前給β3?AR 激動劑BRL37344（5 μg/kg）可減少野生型小鼠在2 h 和24 h 再灌注時的梗塞面積，減少大白豬在梗死后7 d 和45 d 梗塞面積并改善了長期LV 收縮功能，這種保護似乎是通過抑制心肌細胞中mPTP 的開放的途徑實現。此外，阻斷β3?AR 信號傳導會加劇心臟壓力超負荷誘導的重塑，更大的左心室擴張，心肌肥大和纖維化增強，并增強NOS 解偶聯和隨之產生的氧化應激，提示β3?AR 參與了心臟重塑。

綜上所述，目前大多數研究提示β3?AR 激動對梗死后的心臟有保護作用，然而這種心臟保護是哪一種信號傳導通路還需要進一步研究明確。