杜加亮，劉 艷，于晴川，張 永，趙榮榮，趙 巖，韓 菲，劉悅越

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

柯薩奇病毒A16(CV-A16)是小RNA病毒科腸道病毒屬的成員，是引起嬰幼兒手足口病(HFMD)的常見(jiàn)病原體之一[1]。CV-A16是含有約7.4 kb基因組的正義單鏈RNA病毒，其基因組包含5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)、結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P1、非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P2/P3及3′非翻譯區(qū)(3′UTR)。P1編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)，P2和P3分別編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[2]。隨著研究的不斷深入，在分子流行病學(xué)方面，基于VP1基因的完整序列，CV-A16可以在系統(tǒng)發(fā)育上分為A、B、C和D 4個(gè)基因組[3-6]?；蚪MB可以進(jìn)一步分為B1～B4這4個(gè)基因亞型，其中B1基因亞型還可以細(xì)分為B1a～B1d[3,7]。在基礎(chǔ)研究方面，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建感染性克隆[8]，能夠在體外對(duì)病毒基因組進(jìn)行突變、缺失、嵌合等操作后，獲得表型、性狀發(fā)生變化的拯救病毒，為研究其基因的結(jié)構(gòu)與功能、病毒復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)制及篩選候選疫苗提供了嶄新的途徑。在疾病預(yù)防控制方面，單價(jià)腸道病毒71 型(EV-A71)疫苗無(wú)法預(yù)防其他病原體引起的HFMD及其他相關(guān)疾病，應(yīng)研發(fā)多價(jià)HFMD 疫苗[9]，而EV-A71和CV-A16交替或共同流行可引發(fā)世界多個(gè)國(guó)家或地區(qū)HFMD暴發(fā)。本研究從CV-A16的分離、鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析、檢測(cè)方法建立和全基因組克隆構(gòu)建等方面進(jìn)行了一系列研究，以期為CV-A16 病毒的分子流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究提供有利的工具。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 RD細(xì)胞為人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有1%(v/v)L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、2.5%(v/v)NaHCO3溶液(7.5%)、10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)雙抗的Gibco D-MEM培養(yǎng)液。

1.2材料 一步法熒光定量PCR試劑盒(RR064)和一步法反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑(RR057)購(gòu)自TaKaRa公司，QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。糞便處理液為含有終濃度為500 U/mL青霉素和500 μg/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3病毒分離 糞便標(biāo)本來(lái)源于臨床診斷為HFMD和實(shí)驗(yàn)室診斷為CV-A16感染的患者。取糞便標(biāo)本1 g加入10 mL糞便處理液中，渦旋混勻30 s，4 000 r/min離心30 min，取上清，除菌過(guò)濾后接種于RD細(xì)胞。在倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞病變情況，7 d后觀察若未出現(xiàn)細(xì)胞病變，盲傳兩代，直至出現(xiàn)超過(guò)75%的細(xì)胞病變后，將其在—70 ℃以下凍存。

1.4分離毒株的分子生物學(xué)鑒定 步驟1.3中的凍存液反復(fù)凍融3次后，吸取200 μL，按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說(shuō)明書的步驟提取病毒RNA。按照一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑(RR057)說(shuō)明書，利用CV-A16特異性引物CA-VP1-F和CA-VP1-R(終濃度均為10 μmol/L)，進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增VP1基因(反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min)，探針引物信息見(jiàn)表1。目的條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后測(cè)序驗(yàn)證，并參照文獻(xiàn)與GenBank中的已知基因型和亞型的毒株序列進(jìn)行比對(duì)，利用Mega軟件構(gòu)建Neighbour-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5病毒滴度檢測(cè) 將長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成濃度為2×105/mL的細(xì)胞懸液備用；同時(shí)將待測(cè)病毒進(jìn)行10倍系列稀釋，取稀釋度為10-10～10-3的病毒液按每孔50 μL接種細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔；然后立即將細(xì)胞懸液按每孔50 μL加入96孔板；同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照(100 μL細(xì)胞懸液+100 μL病毒稀釋液)，36 ℃培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)胞病變。以能使細(xì)胞發(fā)生病變的病毒最高稀釋度作為終點(diǎn)。在顯微鏡下觀察到細(xì)胞病變記為“+”，否則記為“-”。按Behrens-Krber公式計(jì)算出分離病毒株的病毒滴度(log CCID50)=L—d (S —0.5)，其中：L=實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的log值；d=稀釋梯度的log值；S=終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和(即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和)。

1.6分離毒株對(duì)乳鼠的致病性 將增殖后的病毒懸液反復(fù)凍融3次，然后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。實(shí)驗(yàn)用7 d齡Balb/c乳鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，5只/組，實(shí)驗(yàn)組注射病毒液20 μL(100 CCID50)，對(duì)照組注射等量培養(yǎng)液，顱內(nèi)注射，逐日觀察并記錄乳鼠發(fā)病情況。

1.7全基因組克隆構(gòu)建 參照步驟1.4中的方法提取病毒RNA，利用分片段引物(見(jiàn)表1)，擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。目的條帶經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收后，與pEASY-T3載體連接。轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌感受態(tài)后，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選、酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，提交GenBank。根據(jù)全長(zhǎng)序列酶切位點(diǎn)分析，選擇合適的酶切位點(diǎn)將全長(zhǎng)序列分兩段擴(kuò)增克隆至pVAX載體，構(gòu)建全基因組克隆，酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.8檢測(cè)方法建立

1.8.1RT-PCR方法建立 針對(duì)VP1設(shè)計(jì)引物探針，見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)一步法RT-PCR。1×Taqman universal master mix Ⅱ 25 μL；CA-F(20 μmol/L)、CA-R(20 μmol/L)和CA-P(20 μmol/L)各5 μL，RNA 5 μL；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)。

1.8.2質(zhì)粒參考品制備 將VP1編碼基因克隆入pEASY-T3載體作為質(zhì)粒參考品。質(zhì)粒純度符合要求吸光度(A)260/280為1.8～2.0)后作為備用參考品原液。質(zhì)?？截悢?shù)(copy/μL)按照以下公式計(jì)算：(6.02×1023)×(質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9)/(質(zhì)粒長(zhǎng)度bp×660)。本研究中使用稀釋至106、105、104、103、102copy/μL的質(zhì)粒作為參考品。

表1 探針引物信息

2 結(jié) 果

2.1人感染CV-A16分離株的生物學(xué)特征 成功地從HFMD患者的糞便標(biāo)本中分離到1株CV-A16(BJ1208)。該病毒在RD細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)可以觀察到明顯的致細(xì)胞病變現(xiàn)象，見(jiàn)圖1；在RD細(xì)胞增殖后的病毒滴度為6.8 log CCID 50/mL；以100 CCID50(20 μL)的病毒量在Balb/c乳鼠顱內(nèi)注射后可以觀察到典型的后肢癱瘓癥狀，見(jiàn)圖2。

注：A為人感染CV-A16接種RD細(xì)胞；B為細(xì)胞對(duì)照。

上的細(xì)胞病變現(xiàn)象(×10)

注：A為人感染CV-A16感染小鼠；B為正常小鼠對(duì)照。

肢癱瘓癥狀

2.2人感染CV-A16分離株的分子生物學(xué)特征 分段擴(kuò)增(圖3)測(cè)序后拼接獲得該病毒的完整基因組序列(GenBank Accession No.:JX507808)，全長(zhǎng)7 406 bp，包括745 bp的5′UTR、6 579 bp的蛋白編碼區(qū)(編碼2 193個(gè)氨基酸)及82 bp的3′UTR。根據(jù)CV-A16 VP1序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，該病毒分離株為B1b亞型，且與俄羅斯2007年分離株(KC879501)具有最近的親緣關(guān)系，見(jiàn)圖4。但是與其他病毒相比，明顯不同的是該分離株在VP1編碼蛋白中(688～690 bp處)缺少一個(gè)蛋氨酸，見(jiàn)圖5。但從其生物學(xué)特征來(lái)看，該缺失并不影響病毒復(fù)制和感染能力。

注：M1為DL2000 DNA 標(biāo)記物；M2為1 kb ladder；泳道1-2、3-6、7-8、9-13、14-18分別是CV-A16 F1～F5 5個(gè)PCR擴(kuò)增片段TA克隆的酶切鑒定結(jié)果。

克隆的酶切鑒定結(jié)果

2.3全基因組克隆構(gòu)建 對(duì)全基因組進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，利用一個(gè)單酶切位點(diǎn)(EcoR V)及基因組中未含有的兩個(gè)酶切位點(diǎn)(Pme I 和Not I)，將基因組分成兩個(gè)片段依次擴(kuò)增克隆和連接至載體pVAX1中，構(gòu)建全基因組克隆pVAX1-CA16。經(jīng)酶切(Pme I+ EcoR V)(約3.6和6.9 kb兩個(gè)片段，見(jiàn)圖6)和測(cè)序驗(yàn)證了基因組克隆后未發(fā)生基因突變。

注：▲表示本研究中的病毒分離株BJ1208。

圖5 CV-A16 BJ1208 VP1編碼區(qū)核苷酸比較(部分)

2.4檢測(cè)方法 由4次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)與循環(huán)閾值(Ct值)在102～106copy/μL呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)(Y=-1.602 ln(X)+36.873,R2=0.999 9)，可用作該毒株的定性檢測(cè)和病毒增殖滴度定量檢測(cè)。

注：1為未酶切質(zhì)粒對(duì)照；2為質(zhì)粒經(jīng)Pme I+EcoR V雙酶切；M為DNA標(biāo)記物。

3 討 論

本研究成功從HFMD患者的糞便標(biāo)本中分離到1株在體內(nèi)(Balb/c乳鼠)和體外(RD細(xì)胞)均具有典型生物學(xué)特征的B1b亞型CV-A16(BJ1208)病毒。建立了一套從病毒分離、鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析、全基因組擴(kuò)增和克隆到熒光定量檢測(cè)方法建立的技術(shù)平臺(tái)，為該類病毒的后續(xù)研究提供了參考。

雖然CV-A6、CV-A10等病原體在亞洲、美洲和歐洲逐漸取代EV-A71和CV-A16成為引起HFMD暴發(fā)或流行的主要病原體，但是傳統(tǒng)的病原體仍然不能被忽視[10]。CV-A16感染可導(dǎo)致多種疾病，從輕度HFMD、皰疹性咽峽炎、上下呼吸道疾病到嚴(yán)重并發(fā)癥，如腦炎、癱瘓、脊髓炎、腦膜炎，甚至死亡。CV-A16的基因型和基因亞型眾多，但是型別與疾病嚴(yán)重程度之間的關(guān)系尚不十分明確。CV-A16病毒B1b亞型在我國(guó)多個(gè)省份均有報(bào)道[11]，并且田曉靈等[12]發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)不同臨床癥狀患者中分離出的CV-A16代表株在分子基因型/基因亞型及親緣進(jìn)化關(guān)系樹(shù)分布上雖無(wú)明顯差異，但大部分的重癥病例和死亡病例感染病毒都分布在B1b分支中。本研究中分離到的B1b亞型CV-A16(BJ1208)病毒來(lái)源于重癥患者的糞便標(biāo)本，這提示在疾病監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)重視收集基因型/亞型與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系數(shù)據(jù)，為疾病的治療及疫苗毒株的選擇提供依據(jù)。

通常認(rèn)為，CV-A16 的VP1編碼區(qū)氨基酸序列相對(duì)于其他腸道病毒較為保守，且與其抗原性密切相關(guān)[13]。因此，這一區(qū)域發(fā)生的氨基酸特性改變可能對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)有一定的影響，從而導(dǎo)致毒力的改變[14-17]。本研究中的分離株BJ1208雖然在VP1編碼蛋白中(688～690 bp處)缺少一個(gè)蛋氨酸。但從其生物學(xué)特征和臨床來(lái)看，該缺失并不影響病毒復(fù)制和感染能力。得益于反向遺傳操作技術(shù)的成功應(yīng)用，可以從基因型的改變來(lái)研究表型的變化。以往研究多是利用T7聚合酶系統(tǒng)以線性化的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到CA16病毒基因組RNA，并將CAl6基因組RNA轉(zhuǎn)染至適宜細(xì)胞獲得拯救病毒。而以CMV為啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)病毒拯救的策略可以利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)天然的Ⅱ類RNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，在操作上更為簡(jiǎn)捷[18]，可以用于研究基因突變、缺失或插入等改變對(duì)病毒性狀的影響。

pVAXl是在載體pcDNA3.1的基礎(chǔ)上改建而成的一種新型真核表達(dá)載體，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的唯一一個(gè)可以用于DNA疫苗的載體。該質(zhì)粒含有的強(qiáng)啟動(dòng)子pCMV和BGH poly A信號(hào)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)重組蛋白[19]。與經(jīng)典的T7啟動(dòng)子相比，少了體外轉(zhuǎn)錄的步驟。本研究利用pVAXl作為載體構(gòu)建了全基因組克隆，下一步工作是在此基礎(chǔ)上對(duì)全基因組克隆進(jìn)行改造，如在5′和3′端增加核酶來(lái)提高剪切精確度等[20]，實(shí)現(xiàn)病毒拯救，以期為病毒基因型和表型關(guān)系的研究提供更便捷的工具。

本研究建立了一個(gè)基于CV-A16病毒的分離鑒定體系，以期為復(fù)雜多樣的HFMD病原體的相關(guān)研究提供更多的參考。