王本鑫，王福義，孟凡鑫

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽 110024

丙型肝炎病毒(HCV)感染已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。HCV感染在大多數(shù)感染者中為慢性感染，是肝細(xì)胞癌的主要原因之一[2]。HCV感染發(fā)生在肝細(xì)胞內(nèi)，因此HCV的免疫防御第一線依賴于肝細(xì)胞的內(nèi)在先天免疫[3]。干擾素(IFN)的表達(dá)驅(qū)動(dòng)數(shù)百種干擾素刺激基因(ISG)的表達(dá)，這些ISG編碼先天的免疫效應(yīng)子，這些效應(yīng)子也控制著病毒的復(fù)制和傳播[4]。影響HCV感染的基因包括不同的IRF家族成員、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和其他未知作用機(jī)制的ISG，例如ADAR1[5]。已有研究表明，ADAR1能夠幫助HCV逃避宿主的先天免疫[6]，但是其中的機(jī)制尚不明確。基于此，本研究旨在探討HCV調(diào)控ADAR1逃避先天免疫的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源及主要試劑 Huh7細(xì)胞購自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào)：Huh-7)。引物和DNA探針購自Life Technologies公司。miRNA mimics,miRNA inhibitor、siRNA均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。DMEM培養(yǎng)基購自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào)：XBPY)。HCV Jc1病毒受贈(zèng)于武漢病毒所。QuickextractTMRNA提取試劑盒購自藍(lán)景科信(北京)技術(shù)有限公司(貨號(hào)：QER090150)。DNaseI購自北京普益華科技有限公司(貨號(hào)：AMPD1-1KT)。PrimeScript RT預(yù)混液購自Takara公司(貨號(hào)：RR036Q)。NucleoSpin RNAⅡ試劑盒購自Gene公司(貨號(hào)：740945.50)。ADAR1的3′端非編碼區(qū)由Huh7細(xì)胞基因組擴(kuò)增并插入pMIR載體中構(gòu)成，并命名為ADAR1-3′UTR-WT。ADAR1-3′UTR-MT為ADAR1的3′端非編碼區(qū)中miRNA靶向區(qū)域的堿基突變形式。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并補(bǔ)充葡萄糖(4.5 g/L)、2 mmol/L 1-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉和1X MEM非必需氨基酸，將細(xì)胞放于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將miRNA mimics、miRNA inhibitor、siRNA與Lipofectamine 2000試劑混合，終濃度為100 nmol/L，靜置20 min。然后，將復(fù)合物與2×105個(gè)細(xì)胞混合，并在不存在血清的情況下使用OPTIMEM培養(yǎng)基接種到24孔板中。24 h后，加入含血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h，用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液分離細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以適當(dāng)濃度接種以進(jìn)行病毒感染。同時(shí)，通過測量RNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)來評(píng)估敲除表型。在檢測ADAR1對(duì)HCV感染影響的實(shí)驗(yàn)中，敲低GFP為對(duì)照組，敲低ADAR1為敲低組。在檢測HCV感染對(duì)ADAR1表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，HCV感染細(xì)胞為HCV組，對(duì)照為沒有任何處理的MOCK組。在轉(zhuǎn)染miRNA mimics或miRNA inhibitor的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miRNA mimics或miRNA inhibitor的為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染negative control的為對(duì)照組。在檢測miRNA是否靶向ADAR1 3′端非編碼區(qū)的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染ADAR1-3′UTR-WT的為野生組，轉(zhuǎn)染ADAR1-3′UTR-MT的為突變組。

1.2.2HCV的生產(chǎn) 使用HCV Jc1病毒感染Huh7細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.02，病毒復(fù)制5 d后通過定量感染細(xì)胞中的HCV RNA進(jìn)行檢測。按照制造商的操作規(guī)程，使用QuickextractTMRNA提取試劑盒規(guī)程提取HCV感染細(xì)胞的總細(xì)胞RNA，包括DNaseⅠ處理步驟，提取的RNA保存在—80 °C冰箱中待測，然后用PrimeScript RT預(yù)混液將1 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將該cDNA用于Taqman定量PCR，并使用HCV 5′NC6引物和探針對(duì)病毒HCV RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的檢測。

1.2.3RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 為了進(jìn)行相對(duì)mRNA定量，按照制造商的建議，使用NucleoSpin RNAⅡ試劑盒提取RNA，包括DNaseⅠ處理步驟。反轉(zhuǎn)錄酶使用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒進(jìn)行。通過兩步定量RT-PCR測量所有基因的mRNA相對(duì)水平，并使用2—ΔCt方法將其標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH mRNA表達(dá)。

1.2.4免疫印跡 將細(xì)胞在冰冷的磷酸鹽(PBS)緩沖液中沖洗，并在裂解緩沖液(50 μmol/L Tris HCl pH值7.5、1 μmol/L EDTA，1 μmol/L EGTA，1 μmol/L Na3VO4、10 μmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μmol/L NaF中制備提取物，添加270 μmol/L蔗糖和1%Triton X-100)，并添加蛋白酶抑制劑(Roche)和1 μmol/L苯基甲基磺酰氟。將裂解物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。

2 結(jié) 果

2.1ADAR1抑制HCV感染Huh7細(xì)胞后的先天免疫 使用siRNA敲低ADAR1后(圖1)，敲除組炎癥因子和干擾素的mRNA水平較對(duì)照組均表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。同時(shí)，與對(duì)照組比較，敲低組中IFNγ的分泌水平上升，HCV的復(fù)制水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2和表3。

圖1 siRNA敲低ADAR1的效率

表1 敲低ADAR1后HCV基因組的相對(duì)水平

表2 敲低ADAR1后IFNγ的分泌水平

表3 敲低ADAR1后炎癥因子和干擾素的相對(duì)mRNA水平(siADAR1/control)

續(xù)表3 敲低ADAR1后炎癥因子和干擾素的相對(duì)mRNA水平(siADAR1/control)

2.2HCV感染后ADAR1的表達(dá)水平 與MOCK組比較，HCV組的ADAR1mRNA水平和蛋白水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表4。但是，ADAR1的啟動(dòng)子活性沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

圖2 HCV感染后ADAR1的表達(dá)水平

表4 HCV感染后ADAR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

表5 HCV感染后ADAR1啟動(dòng)子的活性

2.3hsa-miR-135a-5p和hsa-miR-135b-5p靶向ADAR1的3′端非編碼區(qū) miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)有多種潛在靶向ADAR1的miRNA。HCV感染Huh7細(xì)胞后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測上述miRNA，與對(duì)照組比較，hsa-miR-613、hsa-miR-206、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-6803-5p、hsa-miR-4530、hsa-miR-3915的表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)上述miRNA后，與對(duì)照組比較，hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-135a-5p能夠在mRNA水平減少ADAR1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表7。同時(shí)，過表達(dá)hsa-miR-135a-5p或hsa-miR-135b-5p后，與突變組比較，野生組的熒光素酶相對(duì)活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表8。過表達(dá)hsa-miR-135a-5p或miR-135b-5p后，與對(duì)照組比較，ADAR1 的表達(dá)水平均下降，IFNγ的分泌水平上升，HCV的復(fù)制水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；敲低hsa-miR-135a-5p或miR-135b-5p后，與對(duì)照組比較，ADAR1 的表達(dá)水平均上升，IFNγ的分泌水平下降，HCV的復(fù)制水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表9、表10和表11。

表6 HCV感染后miRNA的相對(duì)表達(dá)水平

續(xù)表6 HCV感染后miRNA的相對(duì)表達(dá)水平

表7 過表達(dá)miRNA后ADAR1的相對(duì)表達(dá)水平

注：A為過表達(dá)hsa-miR-135a-5p后ADAR1的蛋白表達(dá)水平；B為敲低hsa-miR-135a-5p后ADAR1的蛋白表達(dá)水平；C為過表達(dá)hsa-miR-135b-5p后ADAR1的蛋白表達(dá)水平；D為敲低hsa-miR-135b-5p后ADAR1的蛋白表達(dá)水平。

表8 過表達(dá)hsa-miR-135a-5p后熒光素酶的活性

表9 過表達(dá)hsa-miR-135b-5p后熒光素酶的活性

表10 hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-5p調(diào)控Huh7細(xì)胞IFNγ的分泌

表11 hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-5p調(diào)控Huh7細(xì)胞中HCV的復(fù)制

3 討 論

HCV感染后，宿主誘導(dǎo)IFN介導(dǎo)一線防御限制病毒復(fù)制，這主要由Ⅰ型IFN介導(dǎo)，并通過誘導(dǎo)多種ISG引起其抗病毒作用[7]。但是，HCV采用了多種策略來逃避宿主的先天免疫監(jiān)視[8-9]。盡管在某些情況下免疫反應(yīng)可以清除HCV，但HCV通常會(huì)導(dǎo)致慢性感染，最終導(dǎo)致肝病和肝細(xì)胞癌[10]。本研究敲低ADAR1后，炎癥因子和干擾素的mRNA水平均上升，INFγ的分泌水平上升，HCV的復(fù)制水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，HCV逃避宿主先天免疫的策略之一是操控ADAR1。

在本研究中，HCV感染Huh7細(xì)胞后，ADAR1在mRNA水平和蛋白水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是，ADAR1的啟動(dòng)子活性沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，HCV調(diào)控ADAR1的水平可能是在mRNA水平上。miRNA是短的RNA序列(19～22 nt)，當(dāng)miRNA的種子區(qū)加入信使的3′UTR區(qū)時(shí)，它調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯，特別是誘導(dǎo)其沉默或降解[11]。miRNA參與組織發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖、組織修復(fù)及病理過程[12]。因此，ADAR1的表達(dá)水平在HCV感染后可能受到miRNA的調(diào)控。過表達(dá)miR-135a-5p或miR-135b-5p后，ADAR1 的表達(dá)水平均下降，IFNγ的分泌水平上升，HCV的復(fù)制水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；敲低miR-135a-5p或miR-135b-5p后，ADAR1 的表達(dá)水平均上升，IFNγ的分泌水平下降，HCV的復(fù)制水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，HCV能夠通過操縱宿主的miRNA促進(jìn)ADAR1的表達(dá)和功能的發(fā)揮。

ADAR催化雙鏈RNA底物中腺苷(A)向肌苷(I)的轉(zhuǎn)化，這一過程具有廣泛的生理作用[13]。人體中存在3種ADAR酶，包括ADAR1、ADAR2、ADAR3[14]。已證明ADAR1在生理和病理狀況(包括感染、自身免疫性疾病和癌癥)中起著更重要的作用[15]。據(jù)報(bào)道，對(duì)ADAR1的抑制刺激了HCV RNA的產(chǎn)生[16]，這表明ADAR1在感染性病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中也是HCV與宿主相互作用的重要影響因素。尚不清楚ADAR1在HCV感染中抗病毒作用的確切機(jī)制。但是，已有研究報(bào)道ADAR1可以調(diào)節(jié)HCV感染細(xì)胞中的PKR激活狀態(tài)，從而抑制IFN刺激的細(xì)胞蛋白合成，但不能抑制HCV IRES依賴性病毒蛋白合成[17]。此外，HCV還通過調(diào)節(jié)PKR激活來控制IFN的產(chǎn)生[18]。通過eIF2介導(dǎo)的翻譯抑制作用，在JFH1 HCV感染的Huh細(xì)胞中發(fā)生PKR介導(dǎo)的IFN誘導(dǎo)抑制作用[19]。因此，筆者猜測ADAR1在HCV感染的情況下是通過以下機(jī)制組合產(chǎn)生抗病毒作用：HCV RNA的A至I編輯通過病毒編碼序列的突變降低HCV蛋白表達(dá)，以及ADAR1的編輯通過抑制干擾素和ISG來阻止HCV復(fù)制。

綜上所述，HCV感染后，Huh7細(xì)胞中hsa-miR-135a-5p和miR-135b-5p的表達(dá)水平下降，其靶向ADAR1 mRNA的3′端非編碼區(qū)的水平下降，隨后ADAR1的表達(dá)水平上升，抑制了宿主的先天免疫，促進(jìn)了HCV的復(fù)制。