何買定，余慧敏，楊 偉，楊永花，蘇文兵

云南省曲靖市第一人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，云南曲靖 655000

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是一種由于外部原因引起的顱腦損傷，當腦組織挫傷后，大量炎癥因子釋放，氧自由基過載引起海馬神經(jīng)元細胞氧化應激，進一步促進TBI的發(fā)展[1-2]，因此，深入探討引起神經(jīng)元細胞氧化應激和炎性反應的分子機制，對臨床治療TBI極為重要。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)在TBI引起的氧化應激和炎性反應中具有重要調(diào)控作用[3-5]，其中miR-124-3p在TBI后表達下調(diào)，上調(diào)miR-124-3p能抑制炎癥因子釋放，緩解TBI的發(fā)展[6]。腦Ras相關蛋白11a(Rab11a)是一種小分子GTP酶，主要參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)吞再循環(huán)過程，近年有研究發(fā)現(xiàn)Rab11a能促進TBI的發(fā)展進程[7]，但有關miR-124-3p通過調(diào)控Rab11a表達緩解TBI引起的氧化應激和炎性反應的研究，目前鮮有報道。為此，本研究將重點探討miR-124-3p/Rab11a分子軸在TBI引起的氧化應激和炎性反應中的作用，為臨床治療TBI提供一定研究方向。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 小鼠海馬神經(jīng)元(HT22)細胞為BNCC細胞庫產(chǎn)品(中國北納)，DMEM培養(yǎng)基和GeneJET RNA 純化試劑盒為Thermo Fisher公司產(chǎn)品(美國)；SYBR Green qPCR 主混合液購自Med Chem Express公司(美國)；qPCR HifairTM Ⅲ 1st Strand cDNA化學合成超混合液購自上海翊圣生物科技有限公司；PCR引物、miR-124-3p mimic/inhibitor由GenePharma公司構建(中國)；pmirGLO熒光素酶靶表達載體及Dual-Luciferase?報告檢測系統(tǒng)購自Promega公司(美國)；活性氧(ROS)活性測定試劑盒購于AmyJet Scientific公司(中國)；免疫印跡一抗及二抗均購自Abcam公司(英國)。

1.2方法

1.2.1HT22細胞的培養(yǎng)、過氧化氫(H2O2)處理及轉(zhuǎn)染 將HT22細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞為空白對照組(BC組)；取10 μmol/L H2O2加入HT22細胞培養(yǎng)基中處理12 h，為氧化應激對照組(OSC組)；HT22細胞在H2O2處理后，根據(jù)LipofectamineTM2000 檢測試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-124-3p mimic、sh-Rab11a和sh-Rab11a+miR-124-3p inhibitor，分別為miR-124-3p mimic組、sh-Rab11a組和sh-Rab11a+miR-124-3p inhibitor組。設3個復孔，轉(zhuǎn)染48 h后置熒光顯微鏡下觀察細胞的轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-124-3p和炎癥因子mRNA的表達 采用RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應體系(20 μL)：10 μL變性后反應液、4 μL 5×PrimeScript緩沖液、0.5 μL RNase Inhibitor、1.0 μL PrimeScript RTase、4.5 μL dH2O。反轉(zhuǎn)錄反應條件：30 ℃ 10 min；45 ℃ 60 min，40個循環(huán)。根據(jù)SYBR Green qPCR主混合液試劑盒說明書檢測mRNA的表達，以U6為檢測miR-124-3p的內(nèi)參對照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為檢測炎癥因子的內(nèi)參對照。引物序列見表1。RT-qPCR反應體系(20 μL)：2.0 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10.0 μL SYBR Green qPCR主混合液、0.4 μL ROX Reference Dye、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、6.0 μL dH2O。RT-qPCR反應條件：95 ℃ 5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,35個循環(huán)。試驗結(jié)果用2-ΔΔCt法計算，每個實驗重復3次。

表1 各項靶標的引物

1.2.3Western blot檢測Rab11a及氧化應激相關蛋白的表達 收集各組細胞提取總蛋白，并檢測硒蛋白N1(SEPN1)、谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達水平；SDS-PAGE分離蛋白條帶后，采用半干轉(zhuǎn)膜法進行轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉避光室溫孵育1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育并過夜；棄去一抗，洗膜緩沖液洗滌后，加入二抗(1∶2 000)，37 ℃避光孵育1 h后，采用增強化學發(fā)光(ECL)液進行顯膜色，凝膠成像儀曝光觀察，拍照記錄，并用Image J軟件進行灰度定量分析。

1.2.4ROS活性檢測 收集處理后的各組細胞(2×105個/mL)重懸于稀釋好的DCFH-DA溶液中，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min；培養(yǎng)期間顛倒混勻4～5次；取出細胞后，采用無血清培養(yǎng)基洗滌3次；采用500 μL無血清培養(yǎng)基，加入到96孔板中，并吹打，在熒光酶標儀激發(fā)波長488 nm處和發(fā)射波長525 nm處檢測熒光強度。

1.2.5雙熒光素酶報告基因試驗驗證miR-124-3p對Rab11a的靶向調(diào)控 擴增Rab11a基因3′-UTR片段，將miR-124-3p與Rab11a結(jié)合部位的序列及其突變體序列插入到pmirGLO 熒光素酶靶表達載體構建載體，將miR-124-3p mimic與pmirGLO-Rab11a-WT/MUT重組質(zhì)粒，對照組與LipofectamineTM2000脂質(zhì)體混合后轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)Dual-Luciferase?報告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.3觀察指標 比較各組miR-124-3p表達、SEPN1、iNOS和GPX1蛋白表達，以及caspase 1、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素18(IL-18)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和ROS水平。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1過表達miR-124-3p對H2O2處理細胞的氧化應激和炎癥因子水平的影響 與BC組比較，OSC組中miR-124-3p表達、SEPN1和GPX1蛋白表達下調(diào)，但caspase 1、IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS蛋白表達和ROS水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OSC組比較，miR-124-3p mimic組中miR-124-3p表達上調(diào)，SEPN1和GPX1蛋白表達上調(diào)，而caspase 1、IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS蛋白表達和ROS水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-124-3p mimic組與BC組比較，所有檢測指標水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2和圖1。

表2 過表達miR-124-3p對H2O2處理HT22細胞的氧化應激和炎癥因子水平的影響

組別ROSiNOS蛋白SEPN1蛋白GPX1蛋白BC組1.00±0.0601.00±0.0401.00±0.0601.00±0.050OSC組1.48±0.051*1.52±0.063*0.53±0.052*0.49±0.072*miR-124-3p mimic組0.98±0.033#0.98±0.028#1.01±0.050#1.01±0.045#P<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 過表達miR-124-3p抑制H2O2處理HT22細胞產(chǎn)生氧化應激相關蛋白表達

2.2miR-124-3p靶向調(diào)控Rab11a的表達 從starBase數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)Rab11a是miR-124-3p潛在下游靶基因(圖2A)。與BC組比較，miR-124-3p mimic組中野生型Rab11a的mRNA和蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，突變型Rab11a中mRNA差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3和圖2。

表3 相對熒光強度和Rablla表達水平

2.3miR-124-3p通過下調(diào)Rab11a抑制H2O2處理HT22細胞氧化應激和炎性反應 與OSC組比較，sh-Rab11a組中Rab11a、iNOS蛋白、ROS、caspase 1、IL-1β、IL-18及TNF-α水平下調(diào)，SEPN1和GPX1蛋白表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與sh-Rab11a組比較，sh-Rab11a+miR-124-3p inhibitor組中Rab11a、iNOS蛋白、ROS、caspase 1、IL-1β、IL-18表達上調(diào)，TNF-α、SEPN1和GPX1蛋白表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。sh-Rab11a+miR-124-3p inhibitor組與OSC組比較，所有檢測指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4和圖3。

表4 miR-124-3p通過Rab11a對H2O2誘導HT22細胞產(chǎn)生氧化應激和炎性反應的影響

組別TNF-αROSiNOS蛋白SEPN1蛋白GPX蛋白OSC組1.00±0.0401.00±0.0601.00±0.0701.00±0.0501.00±0.090sh-Rab11a組0.46±0.043*0.46±0.044*0.66±0.046*1.48±0.034*1.68±0.034*sh-Rab11a+miR-124-3p inhibitor組1.01±0.056#0.98±0.033#0.98±0.033#0.96±0.043#1.02±0.038#P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：A為miR-124-3p和Rab11a的結(jié)合位點；B為Western blot檢測Rab11a蛋白表達水平。

圖3 miR-124-3p通過下調(diào)Rab11a抑制H2O2處理HT22細胞產(chǎn)生氧化應激相關蛋白表達

3 討 論

TBI是一種神經(jīng)外科常見急重癥，其發(fā)生率占全身各部位創(chuàng)傷的9%～21%，病死率及致殘率處于全身各部位創(chuàng)傷首位[8-9]。當腦組織挫傷、顱腦結(jié)構被破壞后，血腦屏障失去功能，外周血循環(huán)中的中性粒細胞、單核巨噬細胞等浸入受損腦組織，啟動一連串分子反應，誘導大量炎癥因子長時間釋放，氧自由基過載并堆積造成活性氧與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)[10-11]，致使海馬神經(jīng)元細胞等多種細胞發(fā)生氧化應激和炎性反應，進一步引起繼發(fā)性腦損傷[12-13]。本研究采用H2O2處理HT22細胞，發(fā)現(xiàn)caspase 1、IL-1β、IL-18、TNF-α及ROS水平均明顯升高，氧化應激相關蛋白SEPN1和GPX1表達降低，而iNOS蛋白表達水平上調(diào)，表明H2O2處理能促進HT22細胞產(chǎn)生氧化應激和炎性反應。此結(jié)果與ZHANG等[10]研究一致，且本研究以此為基礎構建TBI細胞模型，進一步探討miR-124-3p/Rab11a分子軸對TBI引起的氧化應激和炎性反應的作用。

非編碼miRNA在近年來的研究中多次被報道參與了原發(fā)性和繼發(fā)性TBI的發(fā)展進程，并通過自身水平變化促進或緩解TBI由原發(fā)性向繼發(fā)性的惡性轉(zhuǎn)變[14]。此外，miRNA也被證實在TBI氧化應激和炎性反應中具有重要調(diào)節(jié)作用，如LV等[15]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-let-7c-5p能抑制caspase 3、IL-1β等炎癥因子釋放，緩解繼發(fā)性TBI發(fā)展；miR-124-3p在發(fā)生TBI后呈低表達，過表達miR-124-3p能靶向調(diào)控下游蛋白表達，抑制神經(jīng)元發(fā)生炎性反應[16-17]。本研究采用H2O2處理HT22細胞構建TBI細胞模型，發(fā)現(xiàn)在氧化應激和炎性反應環(huán)境中，miR-124-3p明顯低表達，過表達miR-124-3p能恢復由H2O2誘導的炎癥因子caspase 1、IL-1β和IL-18，以及SEPN1、GPX1和iNOS蛋白的特異性表達。本研究結(jié)果與VUOKILA等[16]的研究結(jié)論一致，此外還進一步證實，過表達miR-124-3p能下調(diào)ROS水平，從而緩解HT22細胞所產(chǎn)生的氧化應激。

Rab11a屬于小GTPase超家族的Rab家族，是一種小分子GTP酶，主要參與細胞內(nèi)吞再循環(huán)過程。研究發(fā)現(xiàn)，Rab11a參與調(diào)節(jié)自噬的早、晚期，可促進神經(jīng)元細胞的自噬[18]和炎癥因子的分泌[19-20]，進一步介導繼發(fā)性TBI的發(fā)展。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)Rab11a是miR-124-3p的潛在靶基因。H2O2處理HT22細胞后，HT22細胞中Rab11a高表達，且Rab11a能夠促進HT22細胞氧化應激和炎性反應，此結(jié)果與POEHLER等[18]的研究結(jié)論一致。此外本研究進一步證實，miR-124-3p通過靶向下調(diào)Rab11a能下調(diào)炎癥因子caspase 1、IL-1β、IL-18及ROS水平，上調(diào)SEPN1和GPX1蛋白的表達，并下調(diào)iNOS蛋白水平，從而緩解HT22細胞的氧化應激和炎性反應。

綜上所述，本研究通過模擬體內(nèi)TBI產(chǎn)生氧化應激和炎性反應環(huán)境，從細胞水平證實，miR-124-3p通過靶向下調(diào)Rab11a的表達水平，從而緩解TBI引起的氧化應激和炎性反應。