伏小紅,馮宦翔,茍 偉,楊 敏,郭 靚,屈春燕

四川省成都市第七人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，四川成都 610000

結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌[1]，近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)不少地區(qū)有不斷上升的趨勢(shì)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，普遍的篩查可有效提升CRC患者的生存率，降低其病死率[3]。鑒于篩查的現(xiàn)實(shí)需要和目前篩查方式的不足，急需尋找更方便快捷的篩查方法?；蛐酒突驁D譜是一種很成熟的檢測(cè)技術(shù)，特別適用于篩選差異表達(dá)基因(DEGs)[4]。運(yùn)用生物信息學(xué)方法整合和分析基因芯片應(yīng)用過(guò)程中積累下來(lái)的大量CRC數(shù)據(jù)，并與表達(dá)譜技術(shù)相結(jié)合，非常適用于研究CRC可能存在的生物標(biāo)記物基因。本研究結(jié)合多種數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)展CRC的研究。

1 資料與方法

1.1篩查出有差異的上調(diào)和下調(diào)基因 從基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI-GEO)中獲取GSE110224、GSE41328和GSE15960基因在CRC組織及正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)譜，均是GPL570[G-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，包括28個(gè)正常結(jié)直腸組織標(biāo)本和38個(gè)CRC組織標(biāo)本；采用GEO2R在線(xiàn)工具對(duì)CRC組織標(biāo)本和正常結(jié)直腸組織標(biāo)本的DEGs數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(|logFC|>2和調(diào)整P<0.05)；然后再用Venn軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測(cè)3個(gè)基因芯片之間的差異，logFC<0的DEGs為下調(diào)基因，logFC>0的DEGs為上調(diào)基因。

1.2分析篩選出的DEGs的生物學(xué)特征 在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)里，用基因本體論(GO)分析篩選出的DEGs的生物學(xué)特征，分成生物過(guò)程(BP)組、分子功能(MF)組和細(xì)胞成分(CC)組3組。用京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)分析信號(hào)通路情況。

1.3分析蛋白質(zhì)相互作用 通過(guò)檢索相互作用基因的搜索工具(STRING)分析蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，再用MCODE插件進(jìn)一步分析。

1.4分析篩選出的DEGs對(duì)生存率的影響及對(duì)RNA的表達(dá) 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估篩選出的基因?qū)ι媛实挠绊?，?jì)算出有95%置信區(qū)間的logrankP值和風(fēng)險(xiǎn)比(HR)。利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)交互分析(GEPIA)網(wǎng)站對(duì)標(biāo)本的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1CRC的DEGs分析 用于鑒別的DEGs共包括38份CRC組織標(biāo)本和28份正常結(jié)直腸組織標(biāo)本。通過(guò)GEO2R在線(xiàn)工具，分別從GSE110224、GSE41328和GSE15960中提取出177、290和3 235個(gè)DEGs。用Venn軟件對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集中的常用數(shù)據(jù)集進(jìn)行識(shí)別，共檢測(cè)到62個(gè)常見(jiàn)DEGs(21個(gè)上調(diào)基因，41個(gè)下調(diào)基因)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2DEGs的GO和KEGG通路分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)里采用GO分析篩選出的62個(gè)DEGs，KEGG通路分析表明，下調(diào)的DEGs在腎素分泌和胰腺分泌調(diào)節(jié)信號(hào)通路富集，主要相關(guān)的基因是CLCA1和CLCA4，而上調(diào)的DEGs未見(jiàn)明顯的信號(hào)通路(P<0.05)，見(jiàn)表2、3。

2.3PPI和MCODE插件分析 PPI分析36個(gè)DEGs被導(dǎo)入到含有59個(gè)節(jié)點(diǎn)和60條變的DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體中，62個(gè)DEGs中有36個(gè)被納入到DEGs PPI網(wǎng)絡(luò)，其中包括10個(gè)上調(diào)基因和26個(gè)下調(diào)基因。采用MCODE插件進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，6個(gè)中心節(jié)點(diǎn)均為下調(diào)基因，見(jiàn)圖2。

表1 CRC組織與正常結(jié)直腸組織相比得出的3個(gè)基因芯片都包含的21個(gè)上調(diào)基因和41個(gè)下調(diào)基因

注：A為上調(diào)基因；B為下調(diào)基因；數(shù)據(jù)為DEGs。

2.4UALCAN和GEPIA的核心基因分析 CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)腸腺癌(COAD)和直腸腺癌(READ)兩種癌癥所表達(dá)的數(shù)據(jù)。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)6個(gè)核心基因?qū)RC的預(yù)后影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CLCA1和CLCA4基因低表達(dá)時(shí)對(duì)COAD的預(yù)后有明顯影響(P<0.05)，對(duì)READ無(wú)明顯影響，且剩余4個(gè)基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用GEPIA對(duì)核心基因再進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CRC組織與正常結(jié)直腸組織相比，CLCA1和CLCA4基因在CRC中表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4。

2.5KEGG通路富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)重新對(duì)這3個(gè)篩選出的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示只有CLCA4在腎素分泌的通路中明顯表達(dá)降低(P<0.05)。

表2 CRC的DEGs的KEGG通路分析

注： A為STRING分析PPI結(jié)果；B為MCODE分析所得中心節(jié)點(diǎn)。

注：A為CLCA1基因；B為CLCA4基因;*P<0.05。

表3 CRC的DEGs的GO分析

續(xù)表3 CRC的DEGs的GO分析

注：A為CLCA1的表達(dá)水平對(duì)COAD患者生存率的影響；B為CLCA4的表達(dá)水平對(duì)COAD患者生存率的影響。

3 討 論

CRC作為全球癌癥相關(guān)死亡的第4大原因，在CRC不同發(fā)展階段診斷的患者5年生存率差異很大，早期診斷的患者生存率超過(guò)70%，而晚期診斷的患者生存率不到10%[5]。超過(guò)一半的CRC患者在診斷時(shí)已有局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[6]。并且有研究發(fā)現(xiàn)越年輕的CRC患者預(yù)后也越好[7]，因此如果有便捷的早期篩查方法在常規(guī)體檢或者是轉(zhuǎn)移發(fā)生前及早地發(fā)現(xiàn)CRC，能夠有效提高CRC的生存率。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)3個(gè)芯片進(jìn)行了深入分析，集中研究了多個(gè)基因，與正常結(jié)直腸組織相比，CRC組織中的CLCA1和 CLCA4存在明顯差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的低表達(dá)能夠?qū)OAD患者的生存率產(chǎn)生影響，這一發(fā)現(xiàn)提示CLCA1和 CLCA4可能是診斷和治療CRC的潛在生物標(biāo)志物。但CLCA1和 CLCA4的低表達(dá)通過(guò)GEPIA分析只對(duì)COAD的預(yù)后有明顯影響，而在READ組織中的明顯低表達(dá)卻未對(duì)其預(yù)后有明顯影響，這可能與數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)本收入量等有關(guān)，還需進(jìn)一步做更深入的研究。

CLCA1和CLCA4是鈣活化氯離子通道家族中的成員，與CLCA2一起具有相似的一級(jí)結(jié)構(gòu)。鈣活化氯離子通道調(diào)控因子作為一種在氨基酸末端中具有對(duì)稱(chēng)多半胱氨酸基序的蛋白質(zhì)[8]，在多種癌癥中都出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)[9-10]。同時(shí)，對(duì)鈣活化氯離子通道蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其不僅可以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，還參與致癌[11]，由于其相似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，使其可能在作用效能上也存在類(lèi)似情況。

有研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者的CLCA1血清水平較健康對(duì)照者明顯降低，并且CLCA1血清水平和CLCA1mRNA表達(dá)水平與CRC的轉(zhuǎn)移和分期呈負(fù)相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)CLCA1可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路和上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)揮抑癌作用[12]。異常的Wnt信號(hào)可以觸發(fā)EMT過(guò)程，這在癌癥轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要。CLCA1表達(dá)的增加降低了β-catenin的表達(dá)水平，抑制了EMT從而抑制腫瘤的活性，這與一些文章發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin激活和炎癥性腸病是導(dǎo)致CRC的兩個(gè)主要因素的結(jié)論不謀而合，這兩個(gè)因素能導(dǎo)致腸道內(nèi)腸上皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞，如細(xì)胞增殖增加、細(xì)胞分化和凋亡減少等[13-15]。同時(shí)，EMT過(guò)程使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞失去黏附和極性，從而發(fā)生遷移和侵襲[16]。

對(duì)于CLCA4，近期也有研究指出，CLCA4在細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能是通過(guò)使PI3K/AKT信號(hào)失活和調(diào)節(jié)EMT介導(dǎo)的，并且CLCA4 的降低與CRC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]，這與LIU等[18]發(fā)現(xiàn)的CLCA4抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲的機(jī)制相似。

綜上所述，應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法，本研究篩選出了CLCA1和CLCA4兩個(gè)基因，對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的作用機(jī)制討論，發(fā)現(xiàn)它們嚴(yán)重影響CRC的轉(zhuǎn)移，且最終影響CRC患者的預(yù)后。本研究豐富了CLCA1和CLCA4在CRC中的認(rèn)識(shí)，二者有可能可以作為CRC的診斷依據(jù)和治療靶點(diǎn)。