張素華，徐月新，傅 丹

江蘇省蘇北人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，江蘇揚(yáng)州 225001

羊水細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)是診斷胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測周期長、分辨率較低，無法檢出5 Mb以下的基因組拷貝數(shù)變異(CNVs)。染色體微陣列分析(CMA)為目前主要用于全基因組范圍CNVs檢測的技術(shù)[1]。然而，該技術(shù)成本較高，通量較低，實(shí)驗(yàn)程序較復(fù)雜，因此限制了其在產(chǎn)前診斷中的大規(guī)模使用。而且CMA探針覆蓋范圍有限，導(dǎo)致一部分致病性CNVs可能無法被檢出[2-3]。下一代測序(NGS)技術(shù)的出現(xiàn)，使得CNVs的檢測范圍更廣、通量更大、費(fèi)用更低，報(bào)告周期更短，而且所需DNA量更少，臨床適用性更強(qiáng)[4-6]。雖然國內(nèi)外學(xué)者對基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-Seq)技術(shù)做了一些臨床應(yīng)用探討[7-9]，但國內(nèi)對染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq技術(shù)的臨床應(yīng)用報(bào)道尚不多見。因此，本研究選取了2017-2019年在本院進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并選擇兩種技術(shù)聯(lián)合檢測的316例病例進(jìn)行回顧性分析，以探討羊水細(xì)胞染色體核型分析聯(lián)合CNV-Seq技術(shù)在臨床中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年1月至2019年12月到本院產(chǎn)前診斷中心就診的具備高危指征的單胎妊娠且接受羊膜腔穿刺的孕婦共計(jì)316例，年齡15～48歲，中位年齡30歲；高齡組 (≥35歲)87例(27.53%)， 低齡組(<35歲)229例(72.47%)；孕周17～29周。產(chǎn)前診斷指征主要包括高齡(≥35歲)、產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)、不良孕產(chǎn)史(包括胚胎停育、死胎、流產(chǎn)、胎兒畸形等非正常妊娠情況)、B超指標(biāo)異常(包括結(jié)構(gòu)畸形及軟指標(biāo)異常)、高通量測序無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPS)提示高風(fēng)險(xiǎn)、染色體異常攜帶者、孕婦本人智力落后、孕早期接觸有毒物質(zhì)、妊娠合并其他疾病等。所有接受羊水穿刺的孕婦及家屬均被充分告知羊水細(xì)胞染色體核型分析及CNVs-Seq的臨床意義、穿刺的風(fēng)險(xiǎn)、注意事項(xiàng)，在知情同意及自愿選擇的情況下簽署兩份知情同意書。

1.2儀器與試劑 GSL120全自動(dòng)染色體核型掃描分析系統(tǒng)儀購自德國徠卡公司；Illumina NextSeq500平臺(tái)購自美國Illumina公司；Thermo Forma CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；羊水培養(yǎng)基購自廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司和碧艾生物科技有限公司；秋水仙素購自美國Sigma公司；吉姆薩染液購自上海樂辰生物科技有限公司；枸櫞酸三鈉、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸(分析純AR)、甲醇(分析純AR)均購自國藥集團(tuán)；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；基因組DNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司；測序反應(yīng)通用試劑盒購自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1羊水細(xì)胞染色體核型分析 抽取羊水標(biāo)本后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及中期染色體制備，G顯帶后，每份標(biāo)本至少計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，至少分析5個(gè)核型，至少達(dá)到320條帶水平，按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2009)[10]標(biāo)準(zhǔn)對孕婦染色體命名，如有異常加倍計(jì)數(shù)和分析。

1.3.2CNV-Seq (1)標(biāo)本采集、DNA提取、文庫構(gòu)建及測序：通過羊膜穿刺術(shù)獲取胎兒羊水標(biāo)本5 mL，通過短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)排除母血污染，然后按照基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取胎兒DNA，將50 ng基因組DNA經(jīng)過隨機(jī)消化，末端補(bǔ)平，連接接頭；通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行富集、磁珠純化后得到DNA文庫，最后在Illumina NextSeq500平臺(tái)上對DNA文庫進(jìn)行測序，采用FASTQ數(shù)據(jù)質(zhì)控；檢測分析非整倍體及全基因組范圍CNVs。(2)數(shù)據(jù)判讀：采用ChAS2.0軟件，選取長度≥100 kb缺失/重復(fù)片段(可信度≥90%)進(jìn)行分析。根據(jù)CNVs的性質(zhì)不同，將其分為致病性、可能致病性、致病性未知(意義未明)、可能良性及良性CNVs 5類[11]。為了臨床數(shù)據(jù)分析的需要，本研究只對前3類CNVs進(jìn)行分析[12]。數(shù)據(jù)分析參照在線公共數(shù)據(jù)庫，如OMIM、DGV、DECIPHER等，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行CNVs的判讀。

2 結(jié) 果

本研究中316例孕婦同時(shí)進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法聯(lián)合檢測共發(fā)現(xiàn)49例異常，占受檢人數(shù)的15.51%；其中兩種方法同時(shí)發(fā)現(xiàn)異常共16例，結(jié)果見表1；羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果異常而CNV-Seq未檢出異常的有8例(主要是平衡易位，結(jié)果未顯示)；胎兒CNV-Seq檢測結(jié)果異常而染色體核型分析結(jié)果正常25例，結(jié)果見表2。羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果異常24例，占受檢總?cè)藬?shù)的7.59%，包括染色體數(shù)目異常13例，結(jié)構(gòu)異常11例，結(jié)構(gòu)異常中包括平衡易位8例，非平衡易位3例；CNV-Seq檢測結(jié)果異常41例，占受檢總?cè)藬?shù)的12.97%，包括染色體數(shù)目異常13例，結(jié)構(gòu)異常28例，結(jié)構(gòu)異常包括致病性CNVs 10例，可能致病性CNVs 7例，致病性未知CNVs 11例。

表1 16例羊水細(xì)胞染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結(jié)果

續(xù)表1 16例羊水細(xì)胞染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結(jié)果

表2 25例羊水細(xì)胞染色體核型分析正常及CNV-Seq檢測異常結(jié)果

續(xù)表2 25例羊水細(xì)胞染色體核型分析正常及CNV-Seq檢測異常結(jié)果

3 討 論

胎兒染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常是導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎及新生兒死亡的主要原因，傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析難以發(fā)現(xiàn)染色體亞顯微結(jié)構(gòu)改變，即CNVs。目前為止，已明確由CNVs所致的染色體微缺失及微重復(fù)綜合征已達(dá)300余種[13-14]，綜合發(fā)病率約為1/600[13]，占染色體畸變所致出生缺陷的一半[15]。有研究表明，核型分析正常但超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，有6%～7%存在明確致病或可能致病的CNVs[16-18]。

本研究對316例孕婦進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法聯(lián)合檢測共發(fā)現(xiàn)49例異常，占受檢總?cè)藬?shù)的15.51%。染色體核型分析結(jié)果異常的有24例，占受檢總?cè)藬?shù)的7.59%，CNV-Seq檢測結(jié)果異常的有41例，占受檢總?cè)藬?shù)的12.97%，該技術(shù)對致病或可能致病的染色體異常的檢出率為9.49%(30/316)，與染色體核型分析技術(shù)相比，提高了1.90%的異常檢出率，與其他研究報(bào)道結(jié)果相似[8,11-12]。

CNV-Seq技術(shù)可以檢測出所有的染色體非整倍體異常，如21三體、18三體、性染色體異常，并且對于核型分析無法判斷染色體來源的異常片段能更精準(zhǔn)地定位，對臨床遺傳咨詢及胎兒的去留提供更有力的依據(jù)，如本研究中的12、14、15及16號(hào)孕婦的胎兒。12號(hào)孕婦的胎兒有一條非正常的21號(hào)染色體，且14號(hào)染色體發(fā)生了羅伯遜易位，經(jīng)CNV-Seq檢測分析，發(fā)現(xiàn)為21號(hào)染色體大片段重復(fù)，符合21三體的診斷；14號(hào)孕婦的胎兒染色體核型分析見mar，但不能斷定是Y染色體，CNV-Seq檢測提示為Y染色體，臨床診斷為47,XYY；15號(hào)孕婦的胎兒父親存在著4號(hào)與16號(hào)的染色體平衡易位，所以胎兒染色體中發(fā)生了不平衡的易位，16號(hào)染色體和4號(hào)染色體分別發(fā)生了重復(fù)和缺失，后經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢所引起的臨床表型和B超提示的胎兒先天性心臟病相符合，提示為致病性CNVs；16號(hào)孕婦NIPS提示胎兒其他染色體異?？赡?8號(hào))，經(jīng)CNV-Seq檢測，提示8號(hào)染色體q22.1q24.3區(qū)段存在約48.5 Mb大小的拷貝數(shù)重復(fù)，屬于8號(hào)染色體長臂三體綜合征，臨床表現(xiàn)包括身材矮小、特殊面容、隱睪等，因此該拷貝數(shù)變異也是致病性CNVs。本研究表1中的16例染色體核型分析及CNV-Seq檢測均異常結(jié)果的胎兒，只有1例47，XYY的胎兒在家屬知情同意后保留，其余胎兒家屬知情同意后均選擇引產(chǎn)。

CNV-Seq能夠發(fā)現(xiàn)染色體的微重復(fù)及微缺失。在羊水細(xì)胞染色體核型分析正常的標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)了7例致病性CNVs，7例可能致病性CNVs，11例致病性未知的CNVs。7例致病性CNVs中17、18及19號(hào)孕婦胎兒的異常結(jié)果可以引起臨床常見的DiGeorge綜合征、貓叫綜合征及1p36微缺失綜合征，值得一提的是18號(hào)孕婦胎兒，CNV-Seq提示5p15.33p15.1缺失17.92 Mb，7q34q36.3重復(fù)17.76 Mb，這么大片段的缺失和重復(fù)在核型中為什么沒有明顯地表現(xiàn)出來？后來通過分析發(fā)現(xiàn)原來5號(hào)染色體短臂末端其實(shí)是7q34q36.3易位至此，兩個(gè)缺失和重復(fù)的片段很相似，而兩條7號(hào)染色體正常，所以羊水細(xì)胞染色體核型沒有發(fā)現(xiàn)異常。如果這例孕婦沒有選擇進(jìn)行胎兒的CNV-Seq檢測，則很有可能導(dǎo)致貓叫綜合征的患兒出生，從而給家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，可能致病性及致病性未知的CNVs所占比例也很高，這給臨床遺傳咨詢工作帶來了困難和挑戰(zhàn)，需要結(jié)合胎兒的其他檢查結(jié)果及胎兒父母CNVs的溯源檢測結(jié)果進(jìn)行分析，如果可能致病性及致病性未知的CNVs源自胎兒父母，可能對孕婦的遺傳咨詢有所幫助[19]，如果是新發(fā)的CNVs，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)的建議則需要進(jìn)行隨訪[20]。而對于大多數(shù)的國內(nèi)孕婦，由于CNV-Seq費(fèi)用偏高，一般拒絕做進(jìn)一步的胎兒父母溯源檢測，如果沒有特殊情況則選擇保留胎兒。

CNV-Seq技術(shù)不能檢測染色體的平衡易位及倒位[11,21]，這類攜帶者出生后可能無異常臨床表現(xiàn)，成年后也有生育能力，但因產(chǎn)生異常配子的可能性大，反復(fù)發(fā)生流產(chǎn)，且生育染色體異?；純旱娘L(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。這類攜帶者生育期可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的生育方案，例如自然妊娠后進(jìn)行孕期產(chǎn)前診斷，或者利用胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)選擇診斷正常的胚胎移植[7]。本研究中的8例染色體平衡易位未能被CNV-Seq技術(shù)檢測出，這也說明易位的過程中沒有發(fā)生染色體的微缺失和微重復(fù)，為胎兒的保留提供了有利的證據(jù)。此外，若該異常染色體遺傳來自臨床表型正常的雙親，則大部分胎兒表型仍可能為正常，若為新發(fā)變異則可能破壞或打斷原體內(nèi)正?；虻谋磉_(dá)活性，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因而需要結(jié)合超聲及臨床檢測結(jié)果進(jìn)行充分評估[22]。本研究中8例發(fā)生染色體平衡易位的胎兒均保留，目前隨訪均未見異常表型。

綜上所述，羊水細(xì)胞染色體核型分析和CNV-Seq檢測在產(chǎn)前診斷中各有優(yōu)缺點(diǎn)，遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于分子遺傳學(xué)的檢測結(jié)果，在不增加流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)下，CNV-Seq檢測能為傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)提供有效的補(bǔ)充。兩者聯(lián)合檢測，能為孕婦提供更全面、更精準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷結(jié)果。