劉暢，陳陽，葉佳，朱梅萍

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院消化科，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200437

T 淋巴細胞作為免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，胃癌發(fā)生發(fā)展過程中廣泛存在輔助性T 細胞(helper T cell，Th)亞群免疫紊亂現(xiàn)象。Th17細胞是胃癌組織中最豐富的CD4+T細胞亞群[1]。自2008 年起，有關(guān)胃癌患者腫瘤組織及外周血中Th17 細胞數(shù)量增多及RORγt 及IL-17 表達增加的報道相繼涌現(xiàn)[2-3]。但是，胃癌環(huán)境下CD4+T細胞分化還罕有報道。本研究通過將人胃癌SGC-7901細胞株及人胃癌BGC-823 細胞株與小鼠原代脾臟淋巴細胞共培養(yǎng)，以細胞內(nèi)細胞因子染色FCM 測定Th17 細胞，觀察上述胃癌環(huán)境對Th17細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 小鼠來自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2007-00058。飼養(yǎng)于上海鈺森生物實驗公司，飼養(yǎng)條件為SPF級。

1.2 實驗材料 人胃癌SGC-7901細胞株及人胃癌BGC-823 細胞株均來自來自上海鈺森生物實驗公司；CD3 ε 抗 體 來 自Miltenyi 公 司；IL-17A 抗 體、Cytofix/Cytoperm W/Golgi Stop KitCD4-PE 抗體、CD62L-FITC 抗體均來自BD 公司；胎牛血清及1640培養(yǎng)基來自Gibco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠原代脾臟淋巴細胞分離、分析及鑒定 (1)準備含2%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)，4℃預(yù)冷。(2)在潔凈環(huán)境中取下小鼠脾臟組織，放入預(yù)冷的含2%青鏈霉素的PBS中。(3)在預(yù)冷的含2%青鏈霉素的PBS中剝離去除其他多余組織，并漂洗3遍。(4)把脾臟組織放入一個干凈的6 cm 盤中，用20 mL注射器的活塞膠體部分輕柔碾壓脾臟組織，待組織全部碾碎后加入3 mL PBS 重懸細胞，過篩。(5)將收集的脾單細胞懸液緩慢加入預(yù)先加有等量小鼠淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心15 min。(6)小心吸取單個核細胞，移入另一離心管中，加入CD4 及CD62L 抗體孵育后，進行流式分選。(7)分選后的細胞，PBS洗滌兩次，在流式細胞分析儀上進行檢測，測定分選后細胞的純度。

1.3.2 細胞分組 試驗分為SGC-7901 共培養(yǎng)組、BGC-823共培養(yǎng)組和對照組，分別進行以下操作：(1)24 孔細胞培養(yǎng)板提前1 d 用CD3ε單抗進行包被，4℃孵育過夜。(2)分選后的CD4+CD62L+naiveT 細胞用加有10%熱滅活胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。(3) SGC-7901 共培養(yǎng)組及BGC-823 共培養(yǎng)組分別將提前種板的SGC-7901 或BGC-823 細胞去上清，用無菌PBS 洗滌兩遍后，加入1×107個naiveT 細胞，共培養(yǎng)6 h。對照組將1×107個naiveT細胞加入空板并培養(yǎng)6 h。

1.4 Th17 細胞流式檢測 (1)共培養(yǎng)后，將各組細胞懸液離心，用無菌PBS 洗滌兩遍，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，并加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。(2)取上述細胞懸液置于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 mL，并加丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)(50 μg/L)、離子霉素(1 μmol/L)和蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑莫能菌素(2 μmol/L)以阻止細胞因子向細胞外分泌，在37℃孵箱中培育5 h。(3)流式檢測各組Th17 細胞的比例，以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th17細胞，最終以散點圖IL-17染色陽性表示Th17細胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對各組數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代脾臟淋巴細胞分離后鑒定 經(jīng)檢測，分選后CD4+CD62L 雙陽性細胞比例達到98%以上，可以用于下游實驗，見圖1和圖2。

2.2 三組細胞共培養(yǎng)后Th17細胞流式檢測 以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th17細胞，SGC-7901共培養(yǎng)組、BGC-823共培養(yǎng)組、對照組的CD4+IL-17A+細胞數(shù)量分別為(3.97±0.27)%、(5.17±0.14)%、(1.96±0.29)%，與對照組相比，小鼠淋巴細胞與人胃癌SGC-7901 細胞株及人胃癌BGC-823 細胞株共培養(yǎng)后，Th17 細胞數(shù)量均顯著增多(t=-8.52、-17.141)；與SGC-7901共培養(yǎng)組相比，BGC-823 共培養(yǎng)組Th17 細胞數(shù)量均顯著增多，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.496，P＜0.05)。

圖1 CD4+CD62L雙陽性細胞(分選前)

圖2 CD4+CD62L雙陽性細胞(分選后)

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)第四常見的腫瘤，是腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫細胞的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。T 淋巴細胞是免疫的中心環(huán)節(jié)，根據(jù)在免疫應(yīng)答中功能的不同可分為Th細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)和 細 胞 毒 性 相 比T 細 胞(cytotoxic T cell，Tc)。其中，Th 細胞由CD4+T 細胞分化，是輔助T、B 細胞應(yīng)答的功能亞群。正常情況下，Th 細胞亞群Th1、Th2、Th17、Th9 等處于平衡狀態(tài)，當受到抗原、細胞因子、抗原提呈細胞等刺激時，CD4+T細胞可向不同Th 細胞轉(zhuǎn)化，不同Th 細胞間亦可相互轉(zhuǎn)化。

Th17細胞是胃癌組織中最豐富的CD4+T細胞亞群[2]。自2008 年起，有關(guān)胃癌患者腫瘤組織及外周血中Th17 細胞數(shù)量增多及RORγt 及IL-17 表達增加的報道相繼涌現(xiàn)[3-4]。在胃癌環(huán)境中，STAT3信號通路的激活介導(dǎo)了CD4+T細胞向Th17細胞分化[5]。

IL-17為Th17細胞最主要的效應(yīng)因子，在胃癌中，IL-17 主要起促瘤作用，研究發(fā)現(xiàn)，在表達高水平的IL-17 mRNA 的胃癌患者腫瘤組織中，血管內(nèi)皮細胞和浸潤性嗜中性粒細胞的數(shù)量比在表達低水平的IL-17 mRNA 的腫瘤組織中顯著增多，且腫瘤組織中IL-17 mRNA 的表達水平與腫瘤的深度、淋巴管侵潤和淋巴結(jié)受累有關(guān)[6]。此外，IL-17 基因多態(tài)性、microRNA結(jié)合位點單核苷酸多態(tài)性均與胃癌密切相關(guān)[7-8]。IL-17 的促瘤機制主要包括：(1)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子、前列腺素1、前列腺素2、巨噬細胞炎癥蛋白-2 等促血管生成因子水平，激發(fā)血管內(nèi)皮細胞遷移，促進血管生成以促進腫瘤增殖[6，9]。(2)擴大炎癥反應(yīng)，引起組織增生，誘發(fā)炎癥-腫瘤效應(yīng)，加劇腫瘤發(fā)展，同時減弱趨化因子依賴性的抗腫瘤反應(yīng)[10]。(3)直接促進腫瘤細胞增殖及抗腫瘤細胞凋亡[10]。(4)促進淋巴管形成，參與腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。(5)通過AKT 信號通路，進一步激活STAT3，誘導(dǎo)沉默性胃癌干細胞轉(zhuǎn)化為侵襲性胃癌干細胞[11]。因此，IL-17水平與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)，臨床研究同樣證實高血清IL-17 濃度胃癌患者五年生存率遠低于低血清濃度患者[2，12]。

綜上所述，胃癌環(huán)境存在CD4+T 細胞向Th17 細胞分化增多的現(xiàn)象，過度分化的Th17細胞又加重了胃癌的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 阻斷劑有望在胃癌治療中發(fā)揮作用[13-15]，因此阻斷Th17 細胞分化有望成為治療胃癌的新思路。大量文獻報道了胃癌患者腫瘤組織及外周血中Th17細胞數(shù)量增多的現(xiàn)象，本研究首次證實與兩種胃癌細胞株共培養(yǎng)后，CD4+T細胞向Th17細胞分化均增多，而與SGC-7901共培養(yǎng)組相比，BGC-823共培養(yǎng)組Th17細胞數(shù)量顯著增多，這在細胞學(xué)角度上對胃癌環(huán)境中Th17 細胞的過度分化進行了驗證，后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上繼續(xù)開展，探索以Th17細胞為靶點的抗腫瘤手段。