杜羽琨,周新麗

（上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

人肺腺癌細胞A549既有肺泡上皮細胞的形態(tài)及特性，又表現(xiàn)出典型的肺腺癌惡性特征，廣泛用于體外肺癌發(fā)病基因篩查、藥物篩選等臨床研究[1-2]，因此，臨床研究工作對高質(zhì)量肺癌細胞樣本有較大的需求。低溫保存是樣本庫長期儲存大量肺癌細胞的常用方法，可以在需要時提供大量高質(zhì)量樣本用于臨床基礎研究，以及其他醫(yī)學研究，例如，擴增生物樣品、培養(yǎng)細胞微團、建立人源腫瘤異種移植模型（patient-derived tumor xenograft,PDX）或培養(yǎng)類器官。目前，樣本庫中大多數(shù)細胞樣本采用傳統(tǒng)慢速冷凍方法進行低溫保存，具體方法是采用10%（體積分數(shù)） me2SO作為低溫保護劑，將裝有細胞懸液以及保護劑的凍存管放入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入?80℃冰箱中，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。然而，使用這種方法，復蘇后細胞回收率還不夠高，細胞活力相對新鮮細胞較差，且不同的細胞所適宜的冷凍方法和條件有較大差異[3-6]，所以，有必要針對樣本庫中人肺腺癌細胞A549，研究其適宜的低溫保存方式以及低溫保護劑。

傳統(tǒng)的慢速冷凍降溫過程中，低溫保護劑會出現(xiàn)過冷的現(xiàn)象，溶液結(jié)晶釋放潛熱使樣品溫度迅速回升，導致樣品溫度與冷源溫度的溫差較大，使溶液結(jié)冰速率過快，細胞沒有足夠長的脫水時間，形成胞內(nèi)冰損傷，不利于細胞低溫保存?！爸煤恕笔悄壳白钣邢Ｍ鉀Q過冷問題的方法之一，通過人為的操作，在溶液內(nèi)部形成小范圍低溫區(qū)，以此引發(fā)晶核的形成，消除溶液過冷。Huang等[7]通過在容器外形成局部冷點誘發(fā)成核的置核方法，并配合無Me2SO低溫保護劑對NIH 3T3小鼠成纖維細胞實現(xiàn)了成功的低溫保存，復蘇后細胞回收率為78.1 ± 4.8%，與傳統(tǒng)慢速冷凍組復蘇后的細胞回收率無顯著差異。Zhang等[8]通過手工置核的方法，對牛卵巢組織進行低溫保存，復蘇后原始卵泡的存活率為76.9%±3.5%。目前的置核方法大多需要手動植冰，增加了樣本污染的風險，同時不便于進行大批量細胞的置核。非接觸置核是采用瞬時改變冷源溫度造成管壁外接觸面局部過冷，在接觸面內(nèi)形成穩(wěn)定的晶核，無需采用手動植冰，改變冷凍設備的冷凍程序?qū)崿F(xiàn)大批量的置核。Diener等[9]采用瞬時改變程序降溫儀的降溫速率的方法，先將箱體內(nèi)溫度以2℃/min降溫至?8℃，再在6 s內(nèi)將箱體溫度降溫至?28℃，在這期間凍存管內(nèi)溶液實現(xiàn)了非接觸置核，并使用該方法對肝實質(zhì)細胞進行低溫保存，復蘇后細胞相對新鮮組存活率（86±5%）高于傳統(tǒng)慢速降溫組相對新鮮組存活率（79±5%）。

10%（體積分數(shù)）Me2SO是樣本庫中低溫保存肺癌細胞的常用保護劑。雖然Me2SO能夠降低保存液的冰點，減少胞內(nèi)冰晶形成[10]，但是，Me2SO單獨使用對細胞具有毒性作用，Me2SO通過干擾細胞代謝、酶活性、細胞周期等影響細胞的生長和功能，導致細胞死亡[11]，因此，尋找更安全的冷凍替代方案越來越重要。Kasai等[12]通過對小鼠胚胎的研究表明乙二醇（EG）的毒性小于Me2SO，但對細胞膜的滲透性，Me2SO好于EG[13]。可將兩種滲透性保護劑按一定比例聯(lián)用，減小保護劑的毒性，該組合被廣泛用于卵母細胞的深低溫保存[14]，其效果明顯優(yōu)于單獨使用Me2SO和EG[15-16]。海藻糖是一種非滲透性保護劑，它的添加一方面可避免低溫環(huán)境對細胞膜蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的損傷，另一方面可將細胞膜的蛋白質(zhì)分子進行包裹，使之不易變形，抑制細胞膜融合，降低細胞膜的通透性。

本文首先對肺癌細胞A549低溫保存方法進行了優(yōu)化，在降溫過程中通過快速改變程序降溫儀的降溫速率的方法實現(xiàn)非接觸置核，并與傳統(tǒng)的慢速冷凍降溫程序的過冷度以及細胞凍存效果進行比較。再對肺癌細胞A549低溫保護劑進行優(yōu)化，篩選聯(lián)用EG，Me2SO的體積分數(shù)以及添加海藻糖的最佳濃度，通過檢測復蘇后肺腺癌細胞的回收率，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測細胞的凋亡相關基因表達，對肺癌細胞A549的低溫保存方案進行評估。研究結(jié)果可為凍存大量肺腺癌細胞提供一種操作簡便且效果好的冷凍方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌細胞A549、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基（上海勵瑞生物科技有限公司）；二甲基亞砜（Me2SO）（GIBCO公司）；乙二醇（EG）、海藻糖（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；青霉素、鏈霉素（Sigma公司）。細胞凋亡檢測試劑盒（上海元象醫(yī)療器械有限公司）、RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

將肺癌細胞A549用含10% FBS、1%（體積分數(shù)）青霉素的DMEM完全培養(yǎng)液接種于T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2，70%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞融合度達到80%～90%時，進行消化傳代，以備進行后續(xù)實驗。

1.3 低溫保護劑配置

配制16組不同的低溫保護劑配方。1?4組分別為5%，10%，20%，50%（體積分數(shù)）Me2SO；5?8組為5%，10%，20%，50%（體積分數(shù)）EG；9?11組為7.5%（體積分數(shù)）Me2SO+2.5%（體積分數(shù)）EG，5%（體積分數(shù)）Me2SO+5%（體積分數(shù)）EG，2.5%（體積分數(shù)）Me2SO+7.5%（體積分數(shù)）EG；12?16組為7.5%（體積分數(shù)）Me2SO+ 2.5%（體積分數(shù)）EG分別添加100，200，300，500，1000 mmol海藻糖。將配制好的低溫保護劑用0.22 μm針式濾器過濾除菌，用封口膜封住瓶口，放置于4℃冰箱備用。

1.4 細胞低溫保存與復蘇

肺癌細胞用胰蛋白酶消化后從培養(yǎng)瓶中吸出至離心管中，將離心管放置在離心機中以200 g離心5 min，然后重懸于3 mL凍存液中，細胞密度為1×106個/mL，分別取1 mL細胞懸液加入3支2 mL凍存管中。

傳統(tǒng)慢速冷凍方法：將裝有細胞懸液的凍存管在4℃平衡10 min后，放入程序降溫盒（Nalgene，上海勵瑞生物科技有限公司），再放入?80℃冰箱。該程序降溫盒在?80℃冰箱內(nèi)的降溫速率為1℃/min，24 h后放入液氮中進行長期儲存。

非接觸置核慢速冷凍方法：在Diener等[9]降溫程序基礎上進行修改，將裝有細胞懸液的凍存管在4℃下平衡10 min，隨后將凍存管放入程序降溫儀（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，上海）中，首先將樣本以1℃/min降溫至?9℃；隨后倉體內(nèi)溫度以50.0℃/min 降溫至?50℃，再立刻以15.0℃/min升溫至?25℃并平衡3 min；再將樣品以1.0℃/min 降溫至?50℃；樣本以10.0℃/min降溫至?90℃，最后放入液氮中進行長期儲存。降溫過程中使用程序降溫儀內(nèi)熱電偶對艙體溫度以及樣本中心溫度進行實時監(jiān)測。

復蘇時，從液氮中取出凍存管，在37℃水浴鍋中輕輕快速搖晃凍存管，直至管內(nèi)細胞懸液完全融化。室溫下輕輕吹打細胞懸液后，立即進行活性檢測。

1.5 AO/PI染色

將凍存前和復溫后的細胞吹打混勻，取15 μL細胞懸浮液和15 μL吖啶橙、碘化丙啶（acridine orange/propidium iodide,AO/PI）溶 液，混 勻 靜 置1 min后，滴加在細胞計數(shù)板上，放入細胞計數(shù)儀（Countstar Rigel S2,睿鈺生物科技有限公司，上海）進行統(tǒng)計。細胞回收率A按以下公式進行計算：

式中：α為復溫后活細胞數(shù)；β為凍存前活細胞數(shù)。

1.6 流式細胞術(shù)

將凍存前和復溫后的細胞懸液離心，并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗細胞2次以備使用。按照細胞凋亡檢測試劑盒的操作說明添加試劑，1 h內(nèi)使用流式細胞儀（FACS Calibur TM，碧迪醫(yī)療器械有限公司，上海）進行測試。流式細胞儀可根據(jù)熒光將正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞以及死細胞區(qū)分，并根據(jù)篩選細胞總數(shù)計算處于各個時期的細胞百分率。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-PCR）

將凍存前和復溫后的細胞懸液離心，并用PBS緩沖液清洗細胞2次以備使用。按照PCR TB Green?Premix Ex TaqTMII（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，北京）試劑盒的操作說明，對樣本的抑制細胞凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Bax，Bad進行測定，以β-actin為內(nèi)參基因。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件的ANOVA（analysis of variance）對數(shù)據(jù)進行方差分析、Duncan多重比較。使用Excel和Origin 9.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)慢速冷凍與非接觸置核慢速冷凍方法的比較

采用傳統(tǒng)慢速冷凍與非接觸置核慢速冷凍方法低溫保存肺癌細胞A549，低溫保護劑采用10%（體積分數(shù)）Me2SO，復蘇后細胞回收率如表1所示。使用傳統(tǒng)慢速冷凍法凍存復蘇后細胞回收率為76.06±3.49%。使用非接觸慢速冷凍程序凍存復蘇后細胞回收率為86.72±3.86%。結(jié)果表明，使用非接觸式置核慢速冷凍程序的細胞凍存效果明顯好于使用傳統(tǒng)慢速冷凍程序的細胞凍存效果。

表1 不同低溫保護劑的細胞回收率Tab.1 Cell recovery rate with different cryoprotectants

對傳統(tǒng)慢速冷凍和非接觸置核慢速冷凍法的溫度變化進行測定。傳統(tǒng)慢速冷凍法程序降溫盒中的液體溫度、樣本溫度如圖1（a）所示，當樣品溫度降溫至?19.4℃時，樣本中低溫保護劑出現(xiàn)結(jié)晶，樣本溫度上升，回溫至?10.8℃，溶液過冷度為8.6℃，此時環(huán)境溫度為?34.5℃，樣品與冷源溫差為23.7℃。樣本中溶液結(jié)晶后，樣本溫度先快速降低后緩慢降低，最后跟隨環(huán)境溫度逐漸降低。

圖1 溫度變化曲線Fig. 1 Temperature change curve

非接觸置核慢速冷凍降溫過程中的艙體溫度、樣本溫度如圖1（b）所示，樣品在4℃停留10 min以加載低溫保護劑，之后以1℃/min降溫至?9.0℃，在該溫度進行非接觸置核。調(diào)整程序降溫儀艙體降溫速率，將艙體迅速降溫至?50℃，在管壁接觸面制造局部冷點，在接觸面形成穩(wěn)定的晶核，樣本中溶液出現(xiàn)結(jié)晶并迅速回溫至?5℃，溶液過冷度為4℃，相對傳統(tǒng)慢速冷凍，低溫保護劑的過冷度較低，此時與樣品溫度差為45℃。樣本溫度出現(xiàn)短暫停滯后迅速下降，與此同時艙體溫度上升至?25℃，避免樣本因降溫速率過快，導致細胞不能及時脫水而造成冰晶損傷。艙體溫度在?25℃平衡3 min，隨后環(huán)境溫度緩慢降低，樣本溫度先快速降低，在與環(huán)境溫度不斷接近后，跟隨艙體溫度緩慢降低。

傳統(tǒng)慢速冷凍和非接觸置核慢速冷凍法樣本溫度變化對比如圖1(c)所示。傳統(tǒng)慢速冷凍方法低溫保護劑在?19.4℃開始結(jié)晶，由于低溫保護劑的過冷度較大，造成大量細胞外冰晶形成，且冰晶生長迅速，極有可能對低溫保護劑中的細胞造成機械損傷[17-18]。細胞外冰晶的快速形成，導致細胞內(nèi)水分來不及脫出，造成細胞內(nèi)溶液過冷形成冰晶對細胞造成損傷。溫度的暫時升高也可能導致重結(jié)晶，加劇冰晶損傷[19]。此外，隨著環(huán)境溫度接近?80℃，樣本溫度的降溫速率不斷降低，較慢的降溫速率不利于細胞內(nèi)的溶液非晶態(tài)固化。非接觸式置核慢速冷凍下低溫保護劑在?9℃開始結(jié)晶，由于過冷度較低，形成的冰晶數(shù)量少且生長較慢，從而使細胞內(nèi)水分能夠充分脫出，同時在樣本溫度達到?50.0℃后樣本溫度變化較快，較快的降溫速率可使細胞內(nèi)溶液實現(xiàn)或接近玻璃態(tài)固化，從而減少降溫過程中的冰晶損傷。顯然，非接觸置核慢速冷凍法更符合兩步法對細胞凍存的保護機理。

2.2 不同保護劑對肺癌細胞A549低溫保存效果的影響

目前低溫保護劑種類繁多，它們的毒性和滲透性有很大差別[20]，合理地選擇和配制低溫保護劑至關重要。使用AO/PI染色對復溫后細胞回收率進行檢測，用不同低溫保護劑凍存細胞，復蘇后細胞回收率結(jié)果如表1所示。在DMEM中只添加Me2SO作為低溫保護劑（1?4組），Me2SO體積分數(shù)為10%時，細胞回收率為86.72±3.86%，低溫保存效果最佳。Me2SO體積分數(shù)在20%及以上時，細胞回收率顯著降低（P<0.05），Me2SO體積分數(shù)為50%時，細胞回收率為0.95±0.77%。Me2SO含量越多，保護劑對細胞的滲透及毒性損傷越大，細胞受損越嚴重。在DMEM中只添加EG作為低溫保護劑（5?8組），EG體積分數(shù)為10%時，細胞回收率為82.40±5.40%，保存效果明顯好于其他組（P<0.05），EG體積分數(shù)為50%時，回收率為3.46 ±1.11%。

由于EG的毒性小于Me2SO，使用Me2SO，EG的最優(yōu)體積分數(shù)同為10%，所以，在滲透性保護劑體積分數(shù)恒定的情況下，考慮使用EG取代一部分Me2SO，以此減小低溫保護劑的毒性。對比2，6，9?11組，在聯(lián)用Me2SO，EG添加在DMEM中作為低溫保護劑時，7.5% me2SO + 2.5% EG細胞回收率為88.14±0.61%，保存效果優(yōu)于其他配比。

因使用7.5% me2SO + 2.5% EG配比的保護劑保存效果明顯好于其他組，所以，在此基礎上優(yōu)化海藻糖濃度，進一步提升低溫保存效果。對比9，12?16組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著海藻糖濃度的增加，細胞存活率無顯著差異（P>0.05），但細胞回收率先增大后逐漸減小。在海藻糖濃度為100 mmol/L時，細胞回收率為88.75±1.99%，與不添加海藻糖組無顯著差異（P>0.05），說明低濃度海藻糖不能很好地發(fā)揮保護細胞膜的作用。在海藻糖濃度為200 mmol/L時，細胞回收率為91.59±1.51%，顯著高于其他濃度下的細胞回收率（P<0.05）。

在自然界中，海藻糖是一種重要的小分子，通過維持滲透壓平衡來保護細菌和植物在干燥環(huán)境中生存[21-23]，Kempf等[24]使用10%（體積分數(shù)）Me2SO+200 mmol海藻糖作為低溫保護劑，采用慢速冷凍方法低溫保存人胚胎干細胞，得到了較高的細胞回收率，且使未分化基因得到很好保護。添加海藻糖，一方面，降低了Me2SO體積分數(shù)，使得產(chǎn)生的毒性降低；另一方面，適當添加海藻糖有利于平衡滲透壓，細胞的滲透性損傷和細胞結(jié)構(gòu)及骨架的損傷較小，從而保護細胞膜不破裂，同時減少冰晶的形成。實驗中發(fā)現(xiàn)，海藻糖濃度過低時，對細胞膜和蛋白質(zhì)的保護作用不明顯，添加200 mmol以上海藻糖時，細胞回收率顯著降低，說明較高濃度海藻糖可能會影響細胞膜表面酶的活性，使EG和Me2SO不易進入細胞，導致細胞脫水直至死亡[25]。

2.3 肺癌細胞A549凋亡情況

選取新鮮組以及DMEM，10%（體積分數(shù)）Me2SO，10%（體積分數(shù)）EG，7.5%（體積分數(shù)）Me2SO + 2.5%（體積分數(shù)）EG，7.5%（體積分數(shù)）Me2SO + 2.5%（體積分數(shù)）EG +200 mmol海藻糖這5組溶液保存的細胞進行流式檢測，分析細胞凋亡情況。如圖2所示，新鮮對照組的正常細胞比率為94.44±0.43%，晚期凋亡和壞死細胞為3.68±0.29%。經(jīng)過冷凍后實驗組的正常細胞比例都顯著降低（P<0.05），表明無論添加哪種保護劑，低溫造成的細胞損傷都是不可避免的。未添加保護劑，只使用DMEM冷凍后的正常細胞比率為2.11±0.71%，10%（體積分數(shù)）Me2SO實驗組的正常細胞比率為88.32±0.57%，晚期凋亡和壞死細胞比率為10.59±0.92%，10%（體積分數(shù)）EG實驗組的正常細胞比率為84.61±3.16%，晚期凋亡和壞死細胞比率為12.49±1.73%。7.5%（體積分數(shù)）Me2SO + 2.5%（體積分數(shù)）EG實驗組的正常細胞比率為88.63±1.11%，晚期凋亡和壞死細胞比率為9.36±2.06%，7.5%（體積分數(shù)）Me2SO+2.5%（體積分數(shù)）EG+200 mmol 海藻糖實驗組的正常細胞比率為91.26±0.69%，晚期凋亡和壞死細胞比率為6.66±1.12%，與新鮮組相比差異較小。

圖2 各個時期細胞比率Fig.2 Cell ratio at various stages

2.4 肺癌細胞A549的凋亡相關基因表達

通過RT-PCR檢測，使用7.5%（體積分數(shù)）Me2SO + 2.5%（體積分數(shù)）EG + 200 mmol 海藻糖低溫保護劑，冷凍前、后肺癌細胞A549凋亡相關基因（Bcl-2,Bax 和Bad）表達量的變化如圖3所示。RT-PCR分析結(jié)果表明，低溫保存處理組的RNA表達量的差異較大。Bcl-2基因是一類抑制凋亡基因，對腫瘤細胞的凋亡起抑制作用。如圖3所示，與新鮮組相比，Bcl-2 基因表達量顯著增加（P<0.05）。Bax基因和Bad基因是一類促凋亡基因，與新鮮組相比，冷凍后的各實驗組Bax，Bad基因表達量顯著增加（P<0.05）。

圖3 細胞凋亡相關基因表達量Fig. 3 Apoptosis-related gene expression

相對于新鮮組細胞，7.5%（體積分數(shù)）Me2SO +2.5%（體積分數(shù)）EG + 200 mmol 海藻糖組低溫保存后Bax，Bad基因表達量顯著增加，表明低溫環(huán)境以及低溫保護劑誘導細胞中Bax，Bad基因過表達，加劇了細胞凋亡。同時Bcl-2基因過表達，且明顯高于Bax，Bad基因。Joensuu等[26]發(fā)現(xiàn)在癌變組織內(nèi)Bcl-2的高表達可延長乳腺癌患者的生命。表明7.5%（體積分數(shù)）Me2SO + 2.5%（體積分數(shù)）EG + 200 mmol 海藻糖可以有效地抑制細胞凋亡，提高A549細胞抗凋亡能力。

3 結(jié) 論

對肺癌細胞A549的低溫保存方法及低溫保護劑進行優(yōu)化，研究結(jié)果表明：

a.非接觸式置核慢速冷凍可將低溫保護劑過冷度降低為4℃，使用該低溫保存方法的低溫保存效果優(yōu)于傳統(tǒng)的慢速冷凍，非接觸式置核慢速冷凍和傳統(tǒng)慢速冷凍的細胞回收率分別為86.72±1.86%，76.06±3.49%。

b.7.5%（體積分數(shù)）Me2SO+2.5%（體積分數(shù)）EG+200 mmol海藻糖作為肺癌細胞A549低溫保護劑的細胞回收率（91.59±1.51%）高于使用10%（體積分數(shù)）Me2SO作為肺癌細胞A549低溫保護劑的細胞回收率（86.72 ±1.86%）。

c.流式細胞、RT-PCR結(jié)果顯示，使用7.5%（體積分數(shù)）2SO+2.5%（體積分數(shù)）EG+200 mmol 海藻糖作為低溫保護劑，正常細胞比例最高，且可以很好地抑制細胞凋亡。

肺癌組織研究價值極高，將病變組織與新鮮組織的蛋白表達、基因序列進行檢測，可用于探究其發(fā)病機理以及制作類器官等研究。所以，未來研究應更關注肺癌樣本庫中細胞微團、腫瘤組織的活性及質(zhì)量，這對樣本庫的建立具有十分重要的意義。