張月佳 梁思欣 張嘉嘉 陳 鑫 翁閃凡

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東省佛山市 528000

痤瘡丙酸桿菌(Propionium acnes)是引起痤瘡的主要菌群，痤瘡丙酸桿菌的是一種革蘭氏陽性厭氧桿菌，能聯(lián)同人類皮脂腺細胞分泌皮脂，痤瘡丙酸桿菌的過度增殖能使皮脂腺細胞分泌旺盛，引起皮脂腺角化、固有免疫等反應(yīng)，最終導(dǎo)致炎癥作用[1-2]。痤瘡是一種常見的慢性皮膚疾病，多見于青少年。經(jīng)研究導(dǎo)致痤瘡發(fā)生的常見因素主要有4種：內(nèi)分泌失調(diào)、炎癥和免疫反應(yīng)、皮脂腺的異常角化并形成角栓、丙酸痤瘡桿菌的過度增殖[3]。近年來治療痤瘡的方法有物理治療、藥物治療，藥物治療主要是通過抑制痤瘡丙酸桿菌的生長達到治療痤瘡的目的[4-5]。目前常用的藥物有四環(huán)素、羅紅霉素等抗生素，但隨著耐藥菌的出現(xiàn)，這些抗生素的療效開始下降。我國運用中醫(yī)中藥治療痤瘡已久且療效顯著，中藥治療痤瘡的機制有抑制毛囊皮脂腺微生物生長、抑制皮脂分泌、抗炎免疫等[6]。同時中藥多具有天然活性，成分復(fù)雜，副作用小，不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性，在抗菌研究領(lǐng)域是一個新的研究方向[7]。為此本研究致力于尋找對痤瘡丙酸桿菌抑制效果明顯的中藥。本實驗通過對20種清熱解毒的中藥對痤瘡丙酸桿菌的體外抑制來尋找最為有效的中藥成分，為治療痤瘡提供新的配方。

1 材料與方法

1.1 中藥及制備 中藥黃連(Coptidis rhizoma)、黃芩(Radix scutellariae)、夏枯草(Selfheal)、半枝蓮(Scutellariae barbatae)、金銀花(Honeysuckle)、射干(Blackberry lily)、蒲公英(Herba taraxaci)、白花蛇舌草(Herba hedyotis)、板藍根(Isatis root)、魚腥草(Cordate houttuynia)、決明子(Semen cassiae torae)、知母(Rhizoma anemarrhenae)、梔子(Fructus gardeniae)、大葉青(Big leaf Green)、赤芍(Paeonia veitchii lynch)、牡丹皮(Bark of tree peony root)、蘆根(Rhizoma phragmitis)、菊花(Chrysanthemum)、生地黃(Dried rehamnnia root)、石膏(Gypsum)均購買于佛山市第一人民醫(yī)院藥劑科，上述20味中藥各取30g,分別用500ml蒸餾水浸泡約1h后，在砂鍋中文火煎煮2h，用無菌紗布趁熱過濾煎液，再加入300ml蒸餾水于濾渣中，用同樣的方法煎煮2h，將兩次過濾后的煎液合并至燒杯中，加熱濃縮到30ml，即可得到濃度約為1g/ml的中藥原液，將制備好的藥液裝入瓶中加蓋，于高壓蒸汽滅菌鍋中高壓滅菌(121℃，15min)待冷卻后保存于4℃冰箱備用。

1.2 菌株與試劑 痤瘡丙酸桿菌菌株凍干粉(ATCC11827購自廣東省微生物菌種保藏中心)，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、瓊脂粉、厭氧袋及產(chǎn)氣包均購自青島海博生物。

1.3 細菌復(fù)蘇及菌懸液制備 取痤瘡丙酸桿菌菌株凍干粉，在酒精燈下敲斷安瓿，加0.5ml生理鹽水混勻，接種在平板上，于厭氧環(huán)境中37℃下培養(yǎng)48～72h。菌懸液制備，取新鮮培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌固體平板，在平板上刮取若干單個菌落用液體培養(yǎng)基稀釋至約0.5麥?zhǔn)蠁挝?約為1×108CFU/ml)，在此基礎(chǔ)上，再稀釋10倍(約107CFU/ml)，待用。

1.4 中藥對痤瘡丙酸桿菌抑菌作用初篩實驗 采用牛津杯法：取1.3中制備好的新鮮菌懸液300μl，用涂布棒均勻涂在固體培養(yǎng)基上，待干燥后用鑷子取無菌的牛津杯(直徑8mm)輕放在培養(yǎng)皿表面，輕壓使其接觸良好(一個100mm平板同時可放置4個牛津杯，同時測定4種中藥的活性)，將制備好的中藥藥液200μl放入牛津杯中，用封口膜封好培養(yǎng)皿放入?yún)捬醮糜?7℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72h。觀察結(jié)果，測量抑菌圈，該實驗獨立重復(fù)3次。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>20mm為高敏，抑菌圈直徑10～20mm為中敏,抑菌圈直徑<10mm為耐藥。

1.5 初篩后中藥對痤瘡丙酸桿菌最小抑菌濃度MIC測定 采用96孔板微量肉湯稀釋法：取96孔板，分別在每排的第一個孔加入已稀釋200mg/ml初篩后的中藥藥液200μl，第2～12孔每孔依次加入100μl硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，用排槍從第1孔中取100μl中藥藥液至第2列孔，混勻，依此類推進行倍比稀釋至第10孔，棄去100μl，第1～11孔分別加入0.5麥?zhǔn)蠁挝幌♂? 000倍的痤瘡丙酸桿菌菌液100μl，12孔入補充100μl硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，第11孔為陽性對照，第12孔為陰性對照，將96孔板放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48～72h，最后觀察讀取并記錄MIC。

2 結(jié)果

2.1 中藥抑菌作用初篩結(jié)果 20種中藥經(jīng)過牛津杯法初篩發(fā)現(xiàn)，知母、黃芩、半枝蓮、夏枯草4種中藥有明顯體外抑制痤瘡丙酸桿菌的活性，其中知母根據(jù)3次抑菌圈結(jié)果(24.0±1.0)mm，為高度敏感，黃芩、半枝蓮和夏枯草為中度敏感，抑菌效果從大到小依次為黃芩(18.4±2.0)mm、夏枯草(16.5±1.5)mm、半枝蓮(10.5±0.5)mm。而其他16種中藥對菌株均在牛津杯周圍未形成明顯抑菌圈，故對痤瘡丙酸桿菌明顯無體外抗菌活性。見表1(3次獨立實驗結(jié)果取平均值)。

表1 20種中藥體外抑菌結(jié)果初篩

2.2 4種中藥最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果 用微量肉湯稀釋法檢測知母、黃芩、半枝蓮、夏枯草4種初篩有效果中藥的MIC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑菌濃度分別為0.195mg/ml、6.250mg/ml、3.125mg/ml、6.250mg/ml。知母對痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌作用最為顯著，為0.195mg/ml,黃芩、半枝蓮、夏枯草的作用效果相似，MIC在3～7mg/ml之間。MIC檢測結(jié)果與牛津杯結(jié)果整體上一致，均是知母效果最為顯著，提示知母具有顯著的體外抑制痤瘡丙酸桿菌活性，并且明顯優(yōu)于其他清熱解毒的中藥。

3 討論

痤瘡是一種常見的慢性皮膚疾病，由多因素綜合作用所導(dǎo)致，多見于青少年，但中年也可見。痤瘡可能會導(dǎo)致炎癥后色素沉著和瘀斑，甚至?xí)θ说纳硇睦懋a(chǎn)生影響，嚴重者會導(dǎo)致毀容。痤瘡丙酸桿菌是一種革蘭氏陽性厭氧桿菌，是皮膚正常寄生菌，但同時也是條件致病菌。其作為一種非炎性致炎因素，能使皮脂分泌旺盛，能分解三酰甘油為自身繁殖提供條件，還能激活單核細胞，從而釋放炎癥因子引起炎癥。同時，還是引起痤瘡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一般寄生于人體皮膚毛囊皮脂腺漏斗部，是皮膚的常駐菌群之一。有研究表明痤瘡丙酸桿菌的細胞壁等破碎物能使皮脂分泌增加，使得毛囊皮脂腺導(dǎo)管發(fā)生堵塞，形成有利于痤瘡丙酸桿菌繁殖的厭氧環(huán)境，最終導(dǎo)致皮膚菌群失衡，導(dǎo)致痤瘡發(fā)生。中藥以其濃厚的中國文化背景及其獨特療效，日益受到眾人的關(guān)注[8]。中醫(yī)認為，痤瘡的發(fā)病多于濕、熱、痰、毒有關(guān)，臨床主要分為肺經(jīng)風(fēng)熱、脾胃濕熱、肝氣郁結(jié)等癥狀。中藥治療痤瘡主要用清熱解毒、涼血瀉火及活血化瘀的方劑熬成湯藥應(yīng)用于內(nèi)服或制成膏劑外涂[9]。隨著大家不斷對中藥的深入了解，中藥不斷被用于科學(xué)研究。其中中國傳統(tǒng)中藥資源豐富，毒副作用小，能產(chǎn)生多方面藥理效應(yīng)，具有抑制細菌生長的功效且不易產(chǎn)生耐藥性的特點，已成為如今探索各種細菌抑菌物質(zhì)的方向[10-11]。

本研究從臨床上選擇了20種清熱解毒的中藥，進行痤瘡丙酸桿菌的體外活性嘗試。初步抑菌結(jié)果顯示知母、黃芩、夏枯草、半枝蓮等20種清熱解毒中藥里，知母、黃芩、夏枯草、半枝蓮有明顯抑制痤瘡丙酸桿菌的作用，其中，知母抑制作用最為顯著，在隨后的MIC檢測中，證實知母的MIC最小，為0.195mg/ml,進一步證實知母在體外有非常顯著的抗痤瘡丙酸桿菌作用。知母是百合科知母屬植物，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘苦，性寒。已有研究報道，知母是抗菌活性廣泛的中藥，對葡萄球菌、傷寒桿菌有較強的體外抑制作用，對大腸桿菌、枯草桿菌等也有抑制作用[12-13]，但是對痤瘡丙酸桿菌的研究甚少，主要因為該菌株生長要求比較苛刻。有研究表明某些中藥可阻斷痤瘡丙酸桿菌某些組分的合成或抑制細菌外排泵，從而達到抑菌作用，這僅僅只是其作用的其中一種機制，主要機制還可能在于調(diào)節(jié)人體陰陽平衡，即調(diào)節(jié)機體環(huán)境，從而達到抑制痤瘡丙酸桿菌生長的環(huán)境。總之，痤瘡丙酸桿菌在影響?zhàn)畀徃鱾€核心環(huán)節(jié)起到重要作用，中藥對該菌株在體外有很好的抑菌活性，可為痤瘡的臨床治療提供新的思路，同時也有利于中藥文化的推廣。