李宗吉 朱佳佳 李 琳

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川市 750004；2 寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)中心；3 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院

慢性痛越來越成為危害人類身心健康的重要疾病。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，美國約有1.16億成年人遭受慢性痛的折磨，每年花費(fèi)在慢性痛上的醫(yī)療費(fèi)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出心血管疾病、癌癥和糖尿病三種疾病的總花費(fèi)，在歐洲每5人就有1人患慢性痛[1-3]。神經(jīng)病理性疼痛是臨床最常見的慢性疼痛，是指由于傳入神經(jīng)、脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位受到損傷而引起的疼痛綜合征，多呈難治性，可伴發(fā)睡眠障礙、焦慮、抑郁等神經(jīng)精神疾病，使患者的身心健康及生活質(zhì)量受到極大影響[4-6]。神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，雖然大量文獻(xiàn)報(bào)道免疫、神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道等參與神經(jīng)痛的發(fā)生、發(fā)展的過程，但發(fā)病分子機(jī)制并不清楚，臨床仍然缺乏理想的治療藥物[7-9]。因此，深入研究神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

近幾十年來，隨著高通量測序技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使研究人員能夠更系統(tǒng)全面地開展疾病相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究，更有效地確定影響疾病發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后的關(guān)鍵分子。在本研究中，我們從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫中檢索神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠的芯片檢測數(shù)據(jù)。隨后分析鑒定了一系列差異表達(dá)基因，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)技術(shù)綜合分析神經(jīng)病理性疼痛模型小鼠差異表達(dá)基因。本研究旨在為神經(jīng)病理性疼痛提供新的治療靶點(diǎn)和早期診斷標(biāo)志物，并幫助理解神經(jīng)性疼痛潛在的神經(jīng)病理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取 在美國國立生物中心(NCBI)的 GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載神經(jīng)病理性疼痛mRNA 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE89224。該數(shù)據(jù)集含有9個手術(shù)處理的小鼠 (8～12周)和7個假手術(shù)對照組小鼠。手術(shù)組：小鼠行選擇性神經(jīng)損傷模型(Spared nerve injury,SNI)，脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)用5.0絲結(jié)扎，遠(yuǎn)端切斷，切除2～4mm遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端，同時保留腓腸神經(jīng)完整。假手術(shù)組坐骨神經(jīng)暴露但未結(jié)扎。SNI 7d后，L4～5腰椎取損傷同側(cè)脊髓背角神經(jīng)結(jié)，進(jìn)行總RNA提取?；虮磉_(dá)檢測平臺為GPL341(Affymetrix大鼠表達(dá)230A陣列)。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 差異表達(dá)基因是通過GEO2R分析從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的芯片數(shù)據(jù)，校準(zhǔn)后以P<0.05和|logFC|>2.0作為差異表達(dá)基因篩選準(zhǔn)則。

1.3 差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

1.3.1 分子功能及通路富集分析：將預(yù)測到的差異表達(dá)基因在DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)網(wǎng)站在線進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析，使用Enrichr在線工具(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)進(jìn)行基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。

1.3.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心基因篩選：在string(https://string-db.org/cgi/input.pl)網(wǎng)站在線進(jìn)行靶基因間的蛋白互作分析；采用 Cytoscape3.6.0 軟件對差異表達(dá)蛋白之間的互作關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)蛋白連接度篩選出調(diào)控作用網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心基因。

1.3.3 相關(guān)藥物預(yù)測：在DGIdb數(shù)據(jù)庫(http://dgidb.genome.wustl.edu/)中，預(yù)測靶向核心基因的治療藥物，預(yù)測結(jié)果在cytoscape3.6.0 中可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的鑒定 為確保分析結(jié)果的可靠性，我們首先進(jìn)行數(shù)據(jù)背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化(見圖1)。然后，我們分析篩選發(fā)現(xiàn)了121個差異表達(dá)基因(120個上調(diào)，1個下調(diào))，見表1。

圖1 SNI實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)對照組基因表達(dá)值箱線圖

表1 SNI小鼠差異表達(dá)基因

2.2 GO和KEGG信號通路富集分析 對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG信號通路富集分析，GO分析包括生物學(xué)過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)及細(xì)胞成分(Cell component，CC)。見表2。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI Network) 在cytoscape中對121個分子進(jìn)行互作關(guān)系可視化分析(見圖2)，并依據(jù)分子間的連接度在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出10個核心調(diào)控基因。見圖3。

2.4 hub基因—藥物網(wǎng)絡(luò) 在DGIdb基因—藥物作用數(shù)據(jù)庫中，篩查靶向hub調(diào)控基因的藥物。黃色節(jié)點(diǎn)代表核心基因，綠色節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)藥物。網(wǎng)絡(luò)中共有5個核心基因和16種這些基因的靶向藥物。見圖4。

3 討論

本研究中，我們從GEO數(shù)據(jù)庫下載神經(jīng)病理性疼痛SNI模型小鼠和假手術(shù)對照組小鼠基因表達(dá)芯片檢測數(shù)據(jù)集GSE89224，采用GEO2R篩選差異表達(dá)基因共121個，之后進(jìn)一步生物信息學(xué)分析這些差異表達(dá)基因的生物學(xué)特性并從中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵調(diào)控作用的核心基因。GO和KEGG富集分析的結(jié)果顯示出這些分子的功能和富集通路都與免疫炎癥相關(guān)，以往大量研究也表明，神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞免疫功能的激活是引起神經(jīng)病理性疼痛的主要原因和重要機(jī)制之一[10-12]。

在篩選的hub基因中，Ctss、Rac2、Laptm5、Cd53、C1qb、Ptprc、Tyrobp、Csf1r、Ptpn6、Cd68分子在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，稱為白細(xì)胞共同抗原(Leukocyte

表2 GO與KEGG富集分析結(jié)果

圖2 121個差異表達(dá)基因的分子互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中10個hub基因

圖4 藥物與核心基因作用網(wǎng)絡(luò)

common antigen,LCA)。Ptpn6是細(xì)胞質(zhì)中的重要磷酸酶，其最主要的功能是抑制自身免疫病以及IL-1受體依賴、caspase-1非依賴的自身炎癥性疾病的發(fā)生，中性粒細(xì)胞中特異性刪除Ptpn6會自發(fā)IL-1受體依賴的自身免疫性疾病，這說明Ptpn6會抑制IL-1產(chǎn)生和分泌，但是其中的具體機(jī)制還不清楚[13]。Tyrobp基因編碼跨膜信號傳導(dǎo)多肽，在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)，編碼的蛋白質(zhì)可能與膜糖蛋白的殺傷細(xì)胞抑制受體(KIR)家族相關(guān)，并且可以充當(dāng)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件，該蛋白可能與Zeta鏈(TCR)相關(guān)的蛋白激酶70kDa(ZAP-70)和脾酪氨酸激酶(SYK)結(jié)合，并在信號傳導(dǎo)、骨骼建模、腦髓鞘形成和炎癥中發(fā)揮作用，該基因內(nèi)的突變與多囊性脂膜性骨質(zhì)增生伴有硬化性白質(zhì)腦病(PLOSL)有關(guān)，也被稱為納蘇—哈科拉病。它的特定受體觸發(fā)在髓樣細(xì)胞2(TREM2)上表達(dá)的受體，也會引起PLOSL[14]。Rac2基因編碼RAS超家族成員的鳥苷三磷酸(GTP)代謝蛋白，編碼的蛋白質(zhì)定位于質(zhì)膜，在質(zhì)膜上調(diào)節(jié)分泌、吞噬和細(xì)胞極化等多種過程。這種蛋白的活性也與活性氧的生成有關(guān)，該基因突變與中性粒細(xì)胞免疫缺陷綜合征有關(guān)[15]。Cd68是巨噬細(xì)胞最可靠的標(biāo)記，Cd68表達(dá)于以下細(xì)胞中：單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞、破骨細(xì)胞、肥大細(xì)胞[16]。

此外，4個基因(Cd68、Ctss、Laptm5、Cd53)參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的活動，多項(xiàng)研究表明激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵因素。Cd68是一種被廣泛應(yīng)用的生物標(biāo)記物，用于檢測活化的巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞，其過度表達(dá)代表巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型改變，促炎M1細(xì)胞直接誘發(fā)神經(jīng)痛。Ctss和Laptm5都是小膠質(zhì)細(xì)胞中溶酶體相關(guān)蛋白[17]。Ctss在維持神經(jīng)病理性疼痛中的作用已被證實(shí)，而Laptm5在神經(jīng)痛中的作用暫未明確[18]。神經(jīng)損傷后，細(xì)胞表面黏附分子Cd53在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高，可能與神經(jīng)損傷后細(xì)胞表面黏附分子介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移有關(guān)?？紤]到在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的中早期即有小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，所鑒定的5個基因有可能成為神經(jīng)病理性疼痛的早期診斷生物標(biāo)志物。小膠質(zhì)細(xì)胞有兩個不同的激活狀態(tài)，其中M1促炎反應(yīng)，而M2抑制炎癥反應(yīng)。M1小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎或神經(jīng)毒性因子誘導(dǎo)神經(jīng)痛，而M2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子抑制炎癥，從而減輕神經(jīng)痛。最近的研究表明，雖然M1和M2小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)損傷后都被激活，但小膠質(zhì)細(xì)胞隨著神經(jīng)痛的發(fā)展傾向于向M1表型發(fā)展。這個或許可以解釋為什么抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以減輕神經(jīng)痛，而可不管其表型如何[19-21]。因此，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化，抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)M2小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎作用是神經(jīng)性疼痛的一種有效治療方法。GO和KEGG富集分析也顯示差異表達(dá)基因主要集中在免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞與受體作用，F(xiàn)crR介導(dǎo)吞噬、抗原處理和呈遞，自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，Th17細(xì)胞分化，T細(xì)胞受體信號通路等。這些分析結(jié)果為我們提供了神經(jīng)痛發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。

我們通過構(gòu)建神經(jīng)免疫相關(guān)基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并篩選出核心調(diào)控基因，對這些分子的深入探索或可闡釋神經(jīng)痛的分子病理機(jī)理及為神經(jīng)痛的治療提供藥物作用靶點(diǎn)。我們在DGIdb基因—藥物作用數(shù)據(jù)庫中，篩查靶向核心調(diào)控基因的藥物，網(wǎng)絡(luò)中共篩出5個核心基因和16種藥物，這些藥物主要作用于調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和抑制炎癥反應(yīng)。這些藥物對神經(jīng)痛的療效還需進(jìn)一步展開實(shí)驗(yàn)研究。本研究加深了我們對神經(jīng)病理性疼痛的神經(jīng)免疫機(jī)制的認(rèn)識，生物信息學(xué)篩查出的疾病相關(guān)的核心基因可能會成為神經(jīng)痛早期診斷生物標(biāo)志物或者藥物治療靶點(diǎn)。后續(xù)還需進(jìn)一步對這些基因在神經(jīng)痛中的作用和分子機(jī)理展開深入的研究，以期早日明確神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)理并探索有效的治療方法。