宋 婷，徐云帆，賀婷停，覃 佳，黃 宇，王海燕

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065)

【研究意義】過去10年，細菌小非編碼 RNA (small non-coding RNA，又稱sRNA) 的發(fā)現(xiàn)和功能識別已經(jīng)受到廣泛研究。sRNA通常是由50～500個核苷酸組成，主要由細菌染色體的基因間隔區(qū)編碼產(chǎn)生，絕大多數(shù)sRNA不編碼蛋白質(zhì)，由于sRNA的不完全堿基配對機制使一個sRNA可以與多個靶基因作用，調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)過程[1]。短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)屬于芽孢桿菌屬，是一類重要的生防細菌，它可以分泌抗菌肽、抗菌蛋白以及抗菌素等多種物質(zhì)，對于多種致病病原菌均有明顯的抑制作用，如Zheng Min等[2]研究發(fā)現(xiàn)B.pumilus對于芒果炭疽病的抑制率高達94.28 %。對短小芽孢桿菌中的sRNA研究可以揭示其更多作用機制。【前人研究進展】目前已有大量sRNA被報道，功能得到研究的sRNA大多來自于革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門氏菌。如大腸桿菌中，GcvB是一個長度為206 nt的sRNA，主要功能是調(diào)控氨基酸轉(zhuǎn)運和多肽轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達[3]；sRNA RyhB可以通過與鐵儲存蛋白(如Bfr)和非必需的鐵硫蛋白(如超氧化物歧化酶sodB，sdhCDAB操縱子)等基因的mRNA結(jié)合而抑制這些蛋白的產(chǎn)生[4]。另外在其他菌株中也有少量發(fā)現(xiàn)，如Robert Hertel等[5]發(fā)現(xiàn)枯草桿菌的sRNA AprAs可以通過與aprmRNA結(jié)合抑制枯草桿菌蛋白酶的表達，阻止該sRNA轉(zhuǎn)錄可以提高Apr蛋白表達量，蛋白酶活性增加約4倍；另外，Jiakun Qi等[6]證明了sRNA s015可以通過提高LactococcuslactisF44的耐酸性而提高乳鏈菌肽的產(chǎn)量?！颈狙芯壳腥朦c】B.pumilusSCU11是實驗室早期從土壤中分離并經(jīng)過復(fù)合誘變得到的菌株，前期采用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究了該菌在發(fā)酵過程中9個時間點的轉(zhuǎn)錄組，并利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測出84個大于50 nt的候選非編碼sRNA，Bpsr145是一個長209 nt的候選非編碼sRNA，在不同時間表達水平有較大差異。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過Northern blotting和獨立轉(zhuǎn)錄驗證Bpsr145的表達，使用不同的程序?qū)ζ湫蛄斜Ｊ匦?、二級結(jié)構(gòu)以及靶標(biāo)基因進行分析，建立敲除菌株為探究該sRNA的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

B.pumilusSCU11是實驗室早期從土壤中分離并經(jīng)過復(fù)合誘變得到的；pSUGV4[7]和pUCETs[8]均是E.coli-Bacillus穿梭載體。

1.2 RNA提取和Northern blotting

新鮮的菌液在7500 r/min條件下離心10 min收集菌體，利用TRizol方法提取RNA。Northern雜交電泳的上樣量為10 μg總RNA，用2 %的瓊脂糖甲醛變性電泳，電泳條件：65 V, 2 h；將RNA轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，轉(zhuǎn)膜液為20×SSC，過夜轉(zhuǎn)膜；然后使用紫外交聯(lián)儀進行交聯(lián)，能量為1600×100 μJ/cm；雜交、洗滌、顯色：按照Roche公司的DIG Northern Starter Kit試劑盒方法進行。

1.3 獨立轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建

以pSUGV4為載體，構(gòu)建獨立轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒。以基因組DNA為模板，Bpsr145-F/R (F: 5’-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGAGTAGATGCCTTAGCAGATGTGG TC-3’, R: 5’-CGGTACCCGGGGATCCTAGACAAAC CCTCGCATTCGG-3’) 為引物擴增得到包括Bpsr145啟動子和終止子的完整序列片段，將該片段通過TAKARA公司的In-fusion試劑盒插入經(jīng)PstI和BamHI雙酶切的pSUGV4質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pSUGV4 (145) 。

1.4 敲除載體的構(gòu)建

以實驗室構(gòu)建的溫度敏感型質(zhì)粒pUCETs為載體，構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒。首先在編碼Bpsr145的基因上、下游區(qū)域分別設(shè)計用于同源重組的同源臂，以基因組DNA為模板，Bpsr145-1F/R(1F:5’-CAAGCTTGCATGCCTGCAGATGGTGAGAGTGGGGC

AGA-3’, 1R:5’-CGTCATCATCTGTATGAATCTCCTTGCAAATCTTCTTGAGC-3’) 和Bpsr145-2F/R (2F:5’-GAACGATGACCTCTAATAATTGTCCTTGCAAATC TTCTTGAGC-3’,2R: 5’-CGGTACCCGGGGATCCAATGGGACAGTCATCGCCT-3’) 為引物擴增得到上、下游同源臂Flank1 (742 bp) 和Flank2 (676 bp) ，以質(zhì)粒pSUGV4為模板，kan-F/R (F: 5’-GATTCATACAGATGATGACG-3’, R:5’-CAATTATTAGAGGTCATCGTTC-3’) 為引物擴增出kan基因片段 (1047 bp) ，利用重疊PCR將3個片段連接起來得到Flank1-kan-Flank2 (2465 bp) 片段。將該融合片段通過TAKARA公司的In-fusion試劑盒插入經(jīng)PstI和BamH I雙酶切的pUCETs質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到敲除載體pUCETs-145。

1.5 短小芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化實驗

根據(jù)前期實驗室建立優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化方法[8]進行。

1.6 RNA結(jié)構(gòu)分析

Mfold Web服務(wù)器用于預(yù)測折疊RNA的結(jié)構(gòu)，包括sRNA和靶標(biāo)mRNA[9]。

1.7 靶基因的預(yù)測

使用2個不同程序獲得靶基因預(yù)測：CopraRNA[10]和TargetRNA2[11]，CopraRNA是使用的本地服務(wù)器版本，TargetRNA2可從網(wǎng)頁上獲?。篽ttp://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/。

1.8 生長曲線測定

將保存的菌株劃線在1 %的牛奶LB平板上37 ℃過夜活化，選取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，震蕩過夜。以4 %比例轉(zhuǎn)入50 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)，隔一定的時間進行取樣，適當(dāng)稀釋用分光光度計測定OD600nm數(shù)值。

1.9 胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE

將2個菌株過夜活化，以1 %比例分別轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，將2個菌懸液調(diào)整至OD600nm值為1.0，取6 mL稀釋菌液用PBS緩沖液洗2次，然后用0.6 mL PBS緩沖液重新懸浮，取0.5 mL菌液以1∶1的比例與100～200 μm規(guī)格的玻璃珠混合，在細胞研磨機器上研磨，然后取出破壁后的樣品與loading buffer混勻，100 ℃變性10 min后各取20 μl樣品進行SDS-PAGE。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示Bpsr145是一個差異表達的sRNA

前期采用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究了B.pumilusSCU11在發(fā)酵過程中不同時間的轉(zhuǎn)錄組,從中預(yù)測出84個候選非編碼sRNA。本研究首先對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Bpsr145在不同時間點的表達水平進行分析，比較該sRNA及其鄰近染色體區(qū)域的reads覆蓋情況，了解Bpsr145和附近基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究發(fā)現(xiàn)Bpsr145的表達量在不同時間點變化較大(圖1-A),24 h之前表達水平很低，從36 h開始出現(xiàn)顯著升高，48 h表達量達到峰值，然后開始下降，由此初步推測Bpsr145發(fā)揮功能的主要時期是在36～60 h。Bpsr145位于染色體RI02_RS03660(編碼假設(shè)蛋白)和RI02_RS03665(編碼甲硫氨酸氨基肽酶)2個基因的間隔區(qū)，運用生物信息學(xué)方法分析發(fā)酵48 h時Bpsr145及其上下游基因編碼區(qū)的reads覆蓋情況(圖1-B)，結(jié)果顯示：Bpsr145與上游基因反向部分重疊，由不同的鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生；與下游基因轉(zhuǎn)錄方向相同但是距離較遠，并且中間間隔區(qū)域在不同時間點幾乎沒有reads覆蓋。綜合這些可以推測Bpsr145是一個獨立轉(zhuǎn)錄的sRNA。

2.2 Bpsr145的實驗驗證

Bpsr145的生物信息學(xué)分析顯示該sRNA是一個獨立轉(zhuǎn)錄的sRNA，但仍需進一步實驗驗證，Northern blotting被認為是驗證sRNA的金標(biāo)準(zhǔn)。以LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的短小芽孢桿菌總RNA 作為樣品進行Northern blotting實驗，結(jié)果顯示出一條清晰的雜交條帶，說明Bpsr145在B.pumilusSCU11中真實轉(zhuǎn)錄，實際大小與預(yù)測的209 nt接近(圖2-A)。

通過異源表達實驗驗證Bpsr145是否能獨立轉(zhuǎn)錄。Bacillussubtilis168是芽孢桿菌的模式菌株，B.subtilisWB600是敲除B.subtilis168 中6個蛋白酶基因的改造菌株，將Bpsr 145序列與其基因組對比，并未發(fā)現(xiàn)同源序列，因此用該菌株作為Bpsr145異源表達的宿主。利用短小芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法，將包含Bpsr145啟動子和終止子完整序列的重組質(zhì)粒pSUGV4 (145) 轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600中，得到轉(zhuǎn)化菌株WB600-GV4 (145)，提取轉(zhuǎn)化菌株的RNA，用特異性引物進行RT-PCR(圖2-B)，結(jié)果顯示插入的Bpsr145片段能在B.subtilisWB600發(fā)生獨立轉(zhuǎn)錄，表明短小芽孢桿菌中Bpsr145是一個獨立的轉(zhuǎn)錄單元。

為了揭示Bpsr145在不同培養(yǎng)條件下的表達情況，分別用LB完全培養(yǎng)基和M9基本培養(yǎng)基培養(yǎng)B.pumilusSCU11，提取不同培養(yǎng)時期的RNA樣品通過Northern blotting分析Bpsr145的差異表達情況。結(jié)果(圖2-C)顯示，在LB培養(yǎng)基中，Bpsr145在12 h時開始出現(xiàn)表達，24 h表達水平達到最高，在36～60 h又出現(xiàn)第2次逐步增加的趨勢。在M9基本培養(yǎng)基中，不同的時間點都有表達且差異不大，說明Bpsr145在脅迫條件下表達水平更高。

2.3 Bpsr145的生物信息學(xué)分析

細菌非編碼RNA研究表明，除了極少數(shù)的sRNA具有高度保守的特性外，大多數(shù)sRNA的序列保守性范圍相對狹窄，通常只在同一屬或同一種的不同菌株中存在一定的保守性。將Bpsr145序列進行nBlast比對，得到該序列與43個芽孢桿菌基因組間的保守性結(jié)果：與Bpsr145具有全長相似性的有36個菌株，相似性大于96 %，其中有15個菌株序列一致性達到了100 %，包括B.pumilus,Bacillusaltitudinis以及Bacilluscellulasensis的一些菌株，圖中顯示了該序列與36個菌株之間的系統(tǒng)進化樹(圖3-A)，還有7個菌株只與Bpsr145序列的后半段 (77～209 bp) 具有相似性，包括B.subtilis和B.atrophaeus的一些菌株。另外通過Mfold軟件對Bpsr145的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測(圖3-B)，結(jié)果顯示該sRNA具有小調(diào)控RNA廣泛存在的分子內(nèi)堿基配對的特征結(jié)構(gòu)，包含多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，sRNA的二級結(jié)構(gòu)決定了靶標(biāo)特異性,它們的特定區(qū)域負責(zé)維持其穩(wěn)定性并與靶標(biāo)mRNA的RBS和/或編碼序列(CDS)結(jié)合。

A：系統(tǒng)進化樹，內(nèi)部紅色框表示含有與Bpsr145完全一致的序列的15個芽孢桿菌基因組;B：二級結(jié)構(gòu)A: Phylogenetic tree of Bpsr145, the inner red box indicates 15 genomes which have the completely conserved sequence with Bpsr145;B: Secondary structure圖3 Bpsr145序列保守性和二級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of sequence conservative and secondary structure of Bpsr145

大多數(shù)位于基因間隔區(qū)的sRNA是通過與靶mRNA間不完全的堿基配對來發(fā)揮調(diào)控作用，配對區(qū)通常約10～25 bp。本實驗采用TargetRNA2和CopraRNA對Bpsr145進行靶基因預(yù)測，兩種軟件分別預(yù)測出41和200個靶基因，結(jié)果總結(jié)在韋恩圖中(圖4-A)。兩種軟件均預(yù)測到的靶基因只有5個(圖4-B)，其中3個有注釋信息，其余2個為未知基因：queG編碼tRNA環(huán)氧鳥苷還原酶，與tRNA修飾相關(guān)；prepB編碼蛋白質(zhì)-精氨酸磷酸酶，與氨基酸的磷酸化相關(guān)；hepT編碼庚二烯基二磷酸合酶組分Ⅱ，參與甲萘醌-7(維生素K2-7)側(cè)鏈的生物合成。其他的靶基因主要涉及能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)變、無機離子的轉(zhuǎn)運與代謝、細胞能動性等相關(guān)功能。通過分析靶標(biāo)mRNA功能，可以預(yù)測sRNA參與調(diào)節(jié)的相關(guān)生物學(xué)過程。

A：維恩圖顯示了由TargetRNA2和CopraRNA預(yù)測到的靶基因;B： 2個軟件均預(yù)測到的靶基因A: Venn diagram shows the target genes predicted by TargetRNA2 and CopraRNA;B: The target genes are predicted by two programs圖4 Bpsr145調(diào)控的靶基因預(yù)測Fig.4 Prediction of target genes

2.4 Bpsr145敲除菌株的構(gòu)建及與野生型菌株對比

生物信息學(xué)分析、Northern blotting和獨立轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果表明，Bpsr145是B.pumilusSCU11中獨立轉(zhuǎn)錄、差異表達的sRNA，要進一步研究該sRNA在短小芽孢桿菌中所參與的生理功能，最直接的方法就是建立sRNA的敲除菌株。利用帶有溫度敏感型復(fù)制起點的E.coli-Bacillus穿梭載體pUCETs構(gòu)建Bpsr145敲除載體pUCETs-Bpsr145，然后通過電轉(zhuǎn)化的方法將載體轉(zhuǎn)入野生型菌株SCU11內(nèi)，篩選基因敲除菌株，通過PCR和測序驗證染色體上Bpsr145被kan基因取代，Bpsr145基因被成功敲除，將敲除菌株命名為B.pumilusSCU11 (Δ145) 。

首先對敲除菌株與野生型菌株在LB培養(yǎng)基中的生長情況進行比較，2個菌株的生長曲線顯示 SCU11 (Δ145) 在進入對數(shù)期后比野生型菌株長得慢但差別不是很大，培養(yǎng)至24 h，野生型菌株SCU11進入穩(wěn)定期，敲除菌株SCU11 (Δ145) 菌株直接進入衰亡期(圖5-A)。另外測定了2個菌株在M9基本培養(yǎng)基中的生長曲線，得到的結(jié)果與LB培養(yǎng)基的結(jié)果一致，兩株菌沒有明顯差別(結(jié)果未顯示)。為了檢測Bpsr145的敲除是否影響某些蛋白的表達水平，收集培養(yǎng)至18 h的菌株提取胞內(nèi)蛋白進行SDS-PAGE分析(圖5-B)，發(fā)現(xiàn)突變菌株與野生菌株在胞內(nèi)蛋白產(chǎn)生上也無顯著差別。

除此以外，根據(jù)靶基因的預(yù)測及其涉及的生物學(xué)過程，對菌株在不同溫度下(低溫25 ℃，正常培養(yǎng)溫度37 ℃以及高溫45 ℃)和鐵脅迫條件下 (10 μmol/L FeSO4) 的生長狀況以及菌株的運動性進行測定，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)明顯的表型差異。

3 討 論

Bpsr145是筆者在短小芽孢桿菌SCU11轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到的一個新的非編碼sRNA，本研究通過Northern blotting和獨立轉(zhuǎn)錄實驗證實Bpsr145的真實轉(zhuǎn)錄,長度與預(yù)測大小209 nt相近。進一步對Bpsr145所在基因間隔區(qū)域進行開放閱讀框分析，發(fā)現(xiàn)了一個長138 bp的開放閱讀框，該開放閱讀框與Bpsr145的轉(zhuǎn)錄方向相同，起始密碼子位于Bpsr145序列中間，終止于Bpsr145的3’端后面22個堿基的位置。由于Bpsr145確切的轉(zhuǎn)錄起始位點并未確定，所以Bpsr145基因是否同時也編碼一個小肽呢？過去常認為sRNA是不編碼蛋白質(zhì)的，但是隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)某些sRNA同時還可以編碼小肽，這類sRNA被稱為雙功能sRNA。例如大腸桿菌中的sRNA SgrS就是一個雙功能的sRNA，既具有與靶標(biāo)mRNA堿基配對功能，又可以編碼一個長43個氨基酸的小肽SgrT[12]。另外Matthias Gimpel 等[13]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中的SR1也是一個具有明確雙功能的sRNA，一方面，它以RNA形式與精氨酸代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子abrCmRNA的SD序列結(jié)合，抑制abrCmRNA的翻譯；另一方面，SR1還能編碼一個長39個氨基酸的小肽SR1P，SR1P能與GapA蛋白結(jié)合，從而穩(wěn)定gapAmRNA。到目前為止，已報道的雙功能sRNA數(shù)量很少，Bpsr145是一個單純的非編碼sRNA還是雙功能的sRNA，這些還有待更多的實驗證實。

A：生長曲線;B：SDS-PAGE實驗A: Growth curve;B: SDS-PAGE圖5 敲除菌株與野生型菌株對比研究Fig.5 Comparative study between knock-out and wild strain

本實驗構(gòu)建了sRNA Bpsr145的突變菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bpsr145的敲除對菌株生長過程無明顯影響，胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE分析也顯示胞內(nèi)表達水平高的蛋白條帶無明顯區(qū)別，但并不排除低表達水平的蛋白存在差異。根據(jù)已經(jīng)研究出功能的sRNA來看，sRNA的主要作用是參與各種脅迫應(yīng)答及毒力基因的表達，包括滲透壓脅迫、酸性脅迫或氧化脅迫等，如大腸桿菌中sRNA RprA，在滲透壓刺激下通過堿基配對來促進RpoS合成，使其適應(yīng)環(huán)境[14]；又如sRNA OxyS在氧化應(yīng)激過程中被誘導(dǎo)產(chǎn)生，OxyS可以抑制fhlA和rpoSmRNA的翻譯，他們分別編碼RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄基活因子和σs亞基[15]。綜合對Bpsr145靶基因的預(yù)測結(jié)果，其中desK與溫度信號傳導(dǎo)相關(guān)，fur與鐵離子代謝相關(guān)，flgD與細菌的運動性相關(guān)，本研究對2個菌株不同溫度下的生長狀況、鐵脅迫下生長狀況、以及菌株的運動性進行了測定，結(jié)果2個菌株的生長均并未出現(xiàn)明顯差異，說明Bpsr145可能不參與這些生理功能的調(diào)控，或者Bpsr145在這些功能中只起到協(xié)調(diào)作用，對表型的影響并不明顯。其他研究者也有類似的發(fā)現(xiàn)，很多時候sRNA突變菌株并不會產(chǎn)生明顯的表型變化[16]：一方面的原因可能是由于很多sRNA主要發(fā)揮協(xié)調(diào)作用而非核心調(diào)節(jié)因子，另一方面可能因為大多數(shù)的sRNA是細菌脅迫應(yīng)答的產(chǎn)物，因此突變菌株的表型改變可能是針對特定生理條件下的細微變化。

4 結(jié) 論

本課題通過Norther blotting和獨立轉(zhuǎn)錄實驗證實sRNA Bpsr145是存在于B.pumilusSCU11中的一個sRNA，并通過Northern blotting實驗進一步確認了該sRNA在不同培養(yǎng)條件不同生長時期存在著明顯的差異表達，這也表明Bpsr145可能在某個生理過程中發(fā)揮著作用。對Bpsr145缺失菌株進行了初步分析，目前為止并沒有確認Bpsr145的具體功能，但是通過對短小芽孢桿菌sRNA的研究，一方面可以豐富芽孢桿菌sRNA數(shù)據(jù)庫，另外也為研究短小芽孢桿菌的作用機制提供一個新思路。