朱政清，白維曉，湯雯婷，李海燕

(昆明理工大學醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

【研究意義】土隨著工業(yè)化和城市化進程的加快，土壤重金屬污染問題日趨嚴重。在中國，已有近1/6的耕地(約2000萬km2)受到了不同程度的重金屬污染，給原本就有限的耕地資源帶來了沉重的負擔[1-2]。此外，由于土壤重金屬具有較強的隱蔽性、自然條件下難以降解，其危害往往是多層次、多方面的。在世界范圍內，已有許多關于土壤重金屬污染引起人類疾病的報道[3]，其中包括人體生殖功能疾病，造成胎兒畸形生長，影響兒童和成人的身體素質，對人們正常生活造成威脅等[2]。因此，污染土壤的修復成為環(huán)境研究熱點之一?！厩叭搜芯窟M展】目前的修復方法主要有物理修復、化學修復和生物修復等。在所有修復方法中，植物微生物聯(lián)合修復因其原位、環(huán)保、費用低、操作簡單等特征在重金屬污染土壤修復中展現(xiàn)出較好的應用前景[4-6]，其中植物-內生菌聯(lián)合修復已經取得了一定進展[7-10]。內生菌指生活在健康植物組織內部，不引起宿主植物明顯癥狀改變的微生物。由于與宿主植物協(xié)同進化，形成互利共生關系，一方面內生菌可以從植物獲取營養(yǎng)和避難所，反過來，內生菌也能增強宿主植物的抗逆性[11]。在重金屬脅迫環(huán)境中，植物內也定殖有一定數(shù)量的內生菌[12-13]。內生菌通過產生抗氧化酶、植物促生激素、脫氨酶和脫羧酶等增強植物的抗氧化能力，提高其重金屬抗性，促進其生長發(fā)育，降低重金屬對植物的傷害，在提高宿主生物量的同時，增加植物對重金屬的吸收和積累，提高修復效率[14]。有研究表明，植物內生菌具有吸附(收)重金屬的能力，從而起到固定重金屬離子，降低其在植株內部的含量，從而減輕重金屬脅迫強度[15]?！颈狙芯壳腥朦c】通過前期研究，從重金屬超富積植物小花南芥(Arabisalpina)的種子分離獲得一株重金屬耐受菌株FXZ2(黑附球菌，Epicoccumnigrum)，在重金屬脅迫條件下，該菌株能夠顯著促進小花南芥的生長，影響其重金屬累積能力?！緮M解決的關鍵問題】探索菌株FXZ2對玉米生長及重金屬累積的影響，為FXZ2的應用、以及內生菌與植物互作機制的探索提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米種子為云南曲辰種業(yè)股份有限公司生產的會單4號(滇玉14號)玉米種子。

礦渣堆土壤樣品于2017年8月10日采于云南省曲靖市會澤縣(26°28′N, 103°37′E，海拔2273 m)。采回的土壤樣品于室溫下自然風干、備用。

1.2 無菌苗的獲得

隨機挑選玉米種子按下列程序進行表面消毒：用體積分數(shù)為75 %的乙醇溶液表面消毒10 min，后用無菌水漂洗6次，再用有效氯體積分數(shù)為10 % NaClO溶液表面消毒10 min，無菌水漂洗6次，并于無菌濾紙上吸干水分，均勻放置在8 g·L-1的水瓊脂培養(yǎng)基中，于25 ℃下避光培養(yǎng)3 ～ 5 d。待種子萌發(fā)后，選取無污染且長勢一致的玉米幼苗備用。

1.3 土壤基質的制備與無菌苗的培養(yǎng)

復合重金屬污染土壤的制備：將礦渣堆土過5 mm篩，去除其中的石塊和植物殘渣，之后加入珍珠巖(土壤∶珍珠巖的體積比為7∶3)，混合均勻后121 ℃滅菌20 min，間歇3次，每次間隔24 h，室溫下冷卻、備用。

不同含量Cd污染土壤的制備：按V加拿大水蘚泥炭∶V珍珠巖= 7∶3制備混合土壤，然后分別加入不同量的氯化鎘，制成Cd質量分數(shù)為0 、5 、15、30 mg·kg-1的土壤，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，間歇滅菌3次，每次間隔24 h，室溫下冷卻、備用。

將長勢一致的玉米幼苗隨機移栽至不同重金屬污染的土壤中，于室溫下(18 ～ 25 ℃)自然光照培養(yǎng)。

1.4 FXZ2接種劑和滅活劑的制備及接種

在PDA培養(yǎng)基中活化菌株FXZ2后，接種到PDB培養(yǎng)基中，置于28 ℃、130 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d。之后過濾、取菌絲，轉移至500 mL無菌水中打散制成菌懸液，再將其平均分成2組，一組為FXZ2接種劑，另一組于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min制成FXZ2滅活劑。

將制備好的FXZ2接種劑與滅活劑分別接種到處理組和對照組幼苗上，每株接種3 mL，使其完全濕透。在第1次接種后的第7 、15、30天再各接種1次，共接種4次。

1.5 植物生理指標測定

1.5.1 葉綠素含量測定 在玉米培養(yǎng)37 d后，用葉綠素計(日本柯尼卡美能達公司，SPAD-502 Plus)測定玉米葉片中葉綠素含量[16]。

1.5.2 生物量測定 培養(yǎng)37 d后，將整株植物自土壤中取出，并在自來水下沖洗干凈，用無菌濾紙吸去水分后，測量株高、根長和鮮重。之后將植物放入65 ℃烘箱中，烘至恒重并測量干重。

1.6 植物及土壤中重金屬含量的測定

1.6.1 植物樣品中重金屬含量的測定 將烘至恒重的植物樣品分為地上和地下兩個部分，分別進行重金屬含量的測定[17]。方法如下：將待測樣品置于研缽中，研磨成粉末。稱取200 mg粉末放入消化管中，加入5 mL HNO3(65 % w/w)浸泡過夜。隔天將樣本分別在80 ～ 90、100 ～ 110 和100 ～ 110 ℃的消化爐中消解30、30和60 min，消解后冷卻，加入1 mL H2O2(30 % w/w)，再分別于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30和60 min，消解后冷卻，用三蒸水定容至50 mL，通過火焰原子吸收分光光度法測定其重金屬含量。

1.6.2 土壤樣品中重金屬含量的測定 分別取各處理組植物，按照抖根法[18]收集根際土，并于室溫下自然風干，用5 mm篩除去土壤中殘留的植物根系，再進行研磨，過100目篩后測定其重金屬含量[19]：稱取500 mg待測土壤粉末放入消化管中，加入4 mL HCl-HNO3(3∶1 v/v)混合液浸泡過夜。隔天將分別在80 ～ 90 、100 ～ 110 和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30 、30和60 min，消解后冷卻，加入1 mL HClO4，再分別于100 ～ 110和120 ～ 130 ℃的消化爐中消解30和60 min，消解后冷卻，用三蒸水容至50 mL，通過火焰原子吸收分光光度法測定其重金屬含量。

Mean ± SE，n=30；*代表處理組與對照組有顯著差異(P<0.05),下同Mean ± SE，n=30, * indicated that there was significant difference between the experimental group and the control(P<0.05), the same as below圖1 復合重金屬脅迫下菌株FXZ2對玉米生長的影響Fig.1 The effect of FXZ2 on maize growth under multiple-HMs stress

2 結果與分析

2.1 復合重金屬脅迫下內生真菌FXZ2對玉米生長及重金屬累積的影響

在復合重金屬脅迫下，接種FXZ2(處理組)的玉米存活率為96.7 %，而接種FXZ2滅活劑(對照組)的玉米存活率為83.3 %(圖1)。從圖1可以看出，接種菌株FXZ2顯著促進了玉米的生長，處理組玉米的株高、根長、鮮重和干重均明顯高于對照組(P<0.05)，分別提高了14.03 %、18.82 %、60.69 %和28.89 %。

在復合重金屬脅迫下，處理組與對照組玉米地上部分、地下部分及土壤中Pb、Zn、Cd含量如圖2、圖3～4所示。結果表明，處理組玉米地上部分Zn、Cd含量明顯低于對照組(P<0.05)，分別降低了7.87 %和8.11 %，Pb含量略低于對照組但差異并不顯著；相反，處理組玉米地下部分Pb含量明顯高于對照組(P<0.05)，提高了17.57 %，Zn含量高于對照但差異并不顯著，而Cd含量明顯低于對照組(P<0.05)，降低了4.55 %。處理組根際土壤中Pb、Zn含量明顯低于對照組(P<0.05)，分別降低了8.27 %和16.06 %，而Cd含量高于對照組但差異并不顯著。

圖2 復合重金屬脅迫下菌株FXZ2對玉米地上部分重金屬含量的影響Fig.2 The effect of FXZ2 on aerial parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

圖3 復合重金屬脅迫下菌株FXZ2對玉米地下部分重金屬含量的影響Fig.3 The effect of FXZ2 on underground parts of maize HMs concentration under multiple-HMs stress

2.2 單一重金屬Cd脅迫下內生真菌FXZ2對玉米生長的影響

在單一、不同含量Cd脅迫下，處理組與對照組玉米的生長狀況如圖5所示。當土壤中Cd含量較高(15和30 mg·kg-1)時，接種FXZ2顯著促進了玉米的生長，處理組玉米的根長、鮮重和干重均明顯高于對照組(P<0.05)，分別提高了52.15 %、79.74 %、72.01 %(15 mg·kg-1)和66.01 %、41.07 %、45.2 %(30 mg·kg-1)，株高略高于對照組但差異并不顯著。在土壤中低含量Cd脅迫下，情況略有不同：在質量分數(shù)為0 mg·kg-1時，處理組的株高和根長略高于對照組，鮮重和干重略低于對照組；而在Cd質量分數(shù)為5 mg·kg-1時，處理組的鮮重和干重略高于對照組，株高和根長略低于對照組。

圖4 復合重金屬脅迫下菌株FXZ2對土壤中重金屬含量的影響Fig.4 The effect of FXZ2 on soils HMs concentration under multiple-HMs stress

圖5 不同含量Cd脅迫下菌株FXZ2對玉米生長的影響Fig.5 The effect of FXZ2 on maize growth under different concentration of Cd stress

在單一、不同含量Cd脅迫下，處理組與對照組玉米葉片中葉綠素含量變化如圖6所示。在無Cd脅迫條件下(0 mg·kg-1)，處理組玉米葉片中葉綠素含量明顯低于對照組(P< 0.05)，降低了20.6 %；而在較高含量Cd脅迫下(30 mg·kg-1)，處理組玉米葉片中葉綠素含量卻明顯高于對照組(P<0.05)，提高了12.53 %；而在土壤中Cd質量分數(shù)分別為5和15 mg·kg-1時，處理組和對照組玉米葉片中葉綠素含量并無顯著差異。此外，隨著土壤中重金屬Cd含量的增加，處理組玉米葉片中葉綠素含量總體呈上升趨勢，而對照組并未發(fā)現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。

圖6 不同含量Cd脅迫下菌株FXZ2對玉米葉片中葉綠素含量的影響Fig.6 The effect of FXZ2 on maize leaves chlorophyll content under different concentration of Cd stress

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，無論是在復合重金屬還是在單一重金屬Cd脅迫下， 接種FXZ2明顯促進了玉米的存活和生長。同樣，劉茂軍[20](2009)也發(fā)現(xiàn)在復合重金屬或單一重金屬Pb、Zn、Cd脅迫下，接種深色有隔內生菌(Dark Septate Endophytic Fungi, DSE)顯著促進了玉米的生長。接種該DSE菌株后，玉米根、莖、葉的生物量均明顯高于對照。有研究表明，在重金屬Cd脅迫下，DSE影響合成細胞壁的相關基因的表達與調控，激活玉米合成細胞壁關鍵酶的活性，改變細胞壁組分和Cd吸附配位官能團的分布，強化細胞壁對根系吸收的游離Cd離子的固持與區(qū)室化作用，從而改變Cd離子在玉米根系組織、細胞和亞細胞水平上的分布，進而限制其向原生質體和地上部分的運輸，由此減輕Cd對玉米的毒害[21]。此外，Cd會影響葉綠素酸酷還原酶的活性，從而抑制植物葉綠素合成，葉綠素含量和光合強度隨Cd含量的上升而下降，且葉綠素a比葉綠素b對Cd更敏感[22]。玉米葉片中葉綠素含量間接影響到植物的光合作用，研究中發(fā)現(xiàn)隨著Cd含量增加處理組玉米葉片中葉綠素含量總體呈上升趨勢，而內生菌可直接對植物中葉綠素含量產生直接影響[23]。

在復合重金屬脅迫下，菌株FXZ2顯著影響了玉米各部位對重金屬的累積，接種菌株降低了玉米地上部分Zn和Cd的含量，降低了地下部分Cd的含量卻提高了Pb和Zn的含量，降低了土壤中Pb和Zn的含量。有報道稱，部分真菌可以通過菌絲、泡囊等結構將過量的Pb固定在植物根系，影響植物對Pb的富集特征，顯著降低玉米地上部分Pb含量增加根部Pb含量，有效抑制Pb從根部向地上部分的轉運，降低Pb對植株地上部分的毒害，減少葉片的自由基積累，維持正常的光合作用[24-25]。此外，真菌與宿主植物形成的共生體可以通過催化合成植物螯合態(tài)合成酶( PCs) 螯合細胞質中的重金屬離子，并轉移至植物液泡來有效提高植物對重金屬的耐受性[26]。玉米對Cd具有較強的吸收和積累能力，玉米吸收Cd后主要積累在根部，對Cd脅迫下生長的玉米接種DSE可顯著降低玉米對Cd的吸收以及Cd在玉米地上部分和根部含量，產生這種現(xiàn)象的原因可能是DSE對Cd在玉米體內的化學形態(tài)和亞細胞分布產生影響，從而提高了玉米對Cd的耐性[27]。內生菌可以通過對重金屬離子的吸收和吸附降低植物體內的重金屬脅迫強度，部分內生菌可以通過分泌鐵載體、有機酸、蛋白質等物質與游離態(tài)的重金屬離子形成絡合物，減少其向植物細胞內轉移[15]。

重金屬在植物內富集和轉運的機制與其在植物體內的吸收機制及生物化學過程密切相關，其中Zn是植物必須的微量元素，植物對Zn以代謝吸收為主，Pb、Cd是植物非必需的元素，Cd是易積累的有毒元素，為被動吸收和代謝吸收，Pb元素為被動吸收[28]。接種菌株FXZ2后，玉米對Pb、Zn、Cd的吸收有所不同，Pb、Zn、Cd在玉米不同部位的含量也存在差異，這可能是FXZ2影響了玉米的某些代謝活動所致。如申蜜[21](2017)研究發(fā)現(xiàn)，DSE通過降低玉米根組織中木質部和韌皮部細胞的Cd含量促進Cd在根表皮和皮層細胞的富集，還能顯著增加根細胞壁果膠和半纖維1對Cd的富集，減少CW3中Cd含量的比例。土壤性質、重金屬離子性質及其賦存形態(tài)、以及重金屬離子與其他離子產生的協(xié)同或拮抗作用，均會影響重金屬從土壤向玉米的遷移[29]。所以弄清在Pb、Zn、Cd脅迫下，菌株FXZ2影響玉米生長及Pb、Zn、Cd累積的作用機制，對闡釋內生菌增強宿主植物抗重金屬抗性以及開發(fā)內生菌-植物聯(lián)合修復重金屬污染土壤具有重要意義。

4 結 論

通過盆栽實驗發(fā)現(xiàn)，重金屬耐受內生真菌FXZ2對玉米在不同重金屬脅迫下的生長及重金屬累積能力產生顯著影響：在復合重金屬脅迫下，內生真菌FXZ2顯著促進了玉米的存活和生長；在單一重金屬Cd脅迫下，內生真菌FXZ2促進了玉米在高含量Cd脅迫下的生長。但內生真菌FXZ2對宿主植物產生影響的作用機制還有待研究明確。