潘銀平 馬欣 黨莉婷 蔣艷麗

(1.西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安710038)

不良妊娠結(jié)局是指正常妊娠以外所有的病理妊娠及分娩期并發(fā)癥，包括早產(chǎn)、妊娠糖尿病、死胎及流產(chǎn)等，并對孕產(chǎn)婦及胎兒產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響[1]。因此探究不良妊娠結(jié)局的發(fā)病機制對防治不良妊娠結(jié)局的發(fā)生極其重要。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)全稱為5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，位于人1號染色體1p36.3位置[2]。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C667T位點變異與胚胎停止發(fā)育有關(guān)[3]。甲硫氨酸合成還原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)基因定位于人類染色體5p15.2-15.3，最常見的突變?yōu)锳66G，該突變導(dǎo)致MTRR活性降低，進(jìn)而造成同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝受阻，引起高Hcy血癥，高Hcy血癥與自然流產(chǎn)、妊娠高血壓、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等有關(guān)[4-6]。同時，MTHFR、MTRR還是葉酸和Hcy代謝的關(guān)鍵酶，其基因型在不同國家和地區(qū)呈多態(tài)性分布[7-8]。研究顯示，孕婦體內(nèi)葉酸水平與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，葉酸缺乏可導(dǎo)致神經(jīng)管畸形、胎盤早期剝離和早產(chǎn)等風(fēng)險升高[9-10]。因此本研究通過檢測發(fā)生不良妊娠結(jié)局孕婦血漿中MTHFR、MTRR基因的多態(tài)性，探究二者與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期為臨床防治不良妊娠提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月～2018年6月因不良妊娠于西北婦女兒童醫(yī)院接受治療的有不良妊娠史的88例孕婦作為研究對象(不良妊娠組)，年齡24～40歲，平均年齡(28.64±3.56)歲。另選取同期在本院做產(chǎn)前檢查結(jié)果正常的無不良妊娠結(jié)局史的孕婦95例作為對照組，年齡23～40歲，平均年齡(28.12±3.24)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡22～40歲的女性。②不良妊娠組孕婦均有既往不良妊娠結(jié)局史，如先兆流產(chǎn)、早產(chǎn)等。③對照組孕婦均無過往不良妊娠結(jié)局史。④具備詳細(xì)的臨床病歷資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕婦或其丈夫有染色體異常疾病。②伴隨有嚴(yán)重妊娠高血壓、心臟病等基礎(chǔ)性疾病。③患有多囊卵巢綜合征、子宮畸形等疾病。④患有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等功能不全者。本研究患者及家屬知情并簽署知情同意書，且經(jīng)本院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑和儀器 全血基因組DNA快速抽提試劑盒(美國OMEGA公司)，Taq DNA聚合酶(貨號68N25)、dNTP(貨號NQ2056)、600bp DNA ladder (貨號SM0321)、限制性內(nèi)切酶Hnif Ⅰ(貨號FD0585)、Sma I(貨號FD0596)均購自賽默飛世爾生物科技有限公司，低溫高速離心機(型號FC5714)購自奧豪斯國際貿(mào)易有限公司，-80 ℃超低溫冰箱(型號MDF-86)購自安徽中科都菱商用電器股份有限公司，PCR分析儀(型號ABI7500)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，引物由上海英駿生物工程公司合成并提供。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取及擴增 待孕婦生產(chǎn)前，收集兩組研究對象空腹靜脈血5 mL于抗凝管中置-80 ℃冰箱保存待用。經(jīng)常規(guī)解凍后采用全血基因組DNA快速抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。PCR擴增反應(yīng)體系：滅菌雙蒸水14.2 μL，10×PCR緩沖液2 μl，dNTP 1.6 μL，正向引物與反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，以上三個步驟循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取出離心備用，對產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用限制性內(nèi)切酶Hnif Ⅰ、Sma Ⅰ酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系：10×Buffer 1.5 μL, 0.1×BSA 1.5 μL，Hnif Ⅰ、Sma I 0.8 μL，PCR產(chǎn)物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應(yīng)體積15 μL。反應(yīng)條件：37 ℃下溫浴2 h，10 × Buffer 1.5 μL終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，采用凝膠成像系統(tǒng)分析單核苷酸多態(tài)性基因型結(jié)果。MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點引物序列見表1。

1.3.2 觀察指標(biāo) ①兩組MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點多態(tài)性分析比較。②記錄并比較不良妊娠組患者妊娠結(jié)局情況，包括胎兒宮內(nèi)生長受限(Intrauterine growth restriction，IUGR)、胎死宮內(nèi)、胎兒畸形及早產(chǎn)兒情況。

表1 Taqman-MGB探針?biāo)谖恢?/p>

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA，2011)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用2檢驗；采用Hardy-Weinbery平衡檢測平衡程度。Logistic回歸分析不良妊娠結(jié)局的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點基因多態(tài)性MTHFR基因C677T位點基因型包括：只有152 bp的野生純合型(CC基因型)；既有152bp又有98 bp、54 bp片段的是突變雜合型(CT基因型)；包含98 bp和54 bp的突變純合型(TT基因型)。MTRR基因A66G位點基因型包括：僅有372bp的野生純合型(AA基因型)；既有372bp又含有209bp及163bp的突變雜合型(AG基因型)；包含209bp及163bp的突變純合型(GG基因型)，見圖1。

圖1 MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點基因多態(tài)性

2.2 Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，對照組與不良妊娠組MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點各基因型的期望值和觀察值進(jìn)行2檢驗，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究具有代表性,見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結(jié)果(n)

2.3MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點多態(tài)性分析 與對照組相比，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高(P<0.05)；MTRR基因A66G位點AG、GG及G等位基因頻率顯著升高(P<0.05)，見表3、表4。

2.4MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點與不良妊娠結(jié)局關(guān)系MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子TT型及MTRR基因A66G位點野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型患者IUGR、胎死宮內(nèi)、胎兒畸形、早產(chǎn)兒發(fā)生率均依次升高，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5、表6。

2.5Logistic回歸分析不良妊娠結(jié)局的影響因素 以是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局為因變量，以MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型為自變量進(jìn)行二元logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點雜合子AG型、純合子GG型是不良妊娠結(jié)局發(fā)生的危險因素(P<0.05)，見表7。

表3 MTHFR基因C677T位點多態(tài)性分析[n(×10-2)]

表4 MTRR基因A66G位點多態(tài)性分析[n(×10-2)]

表5 MTHFR基因C677T位點與不良妊娠結(jié)局關(guān)系[n(×10-2)]

表6 MTRR基因A66G位點與不良妊娠結(jié)局關(guān)系[n(×10-2)]

表7 Logistic回歸分析不良妊娠結(jié)局的影響因素

3 討論

不良妊娠結(jié)局包括早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)、胎兒畸形等疾病，并對孕婦和胎兒產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響。因此，妊娠早期識別這類高危妊娠將有助于臨床進(jìn)行預(yù)防性控制，降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率。近年來，葉酸及Hcy水平等影響孕婦妊娠結(jié)局的物質(zhì)受到越來越多的關(guān)注，而MTHFR及MTRR基因多態(tài)性對葉酸和Hcy的代謝具有重要的影響[3,5]。

MTHFR是調(diào)節(jié)半胱氨酸和四氫葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其C677T位點突變是胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致MTHFR多肽中的纈氨酸取代了丙氨酸，使MTHFR活性降低約34%～75%[11-12]。MTRR基因A66G位點突變，導(dǎo)致異亮氨酸被蛋氨酸取代，該位點突變后使甲基維生素B12生成減少，引起血清Hcy的水平升高[13]。林寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，中國江蘇部分地區(qū)孕前女性人群中存在MTHFR基因C677T位點突變，孕婦體內(nèi)出現(xiàn)高Hcy和低葉酸的現(xiàn)象。研究認(rèn)為Hcy可能參與先天性心臟病發(fā)病機制中，其代謝異常是誘發(fā)先天性心臟病的一個獨立危險因素[15]。研究顯示，與正常孕婦相比，妊娠期高血壓患者血清Hcy水平升高，經(jīng)規(guī)范化補充葉酸后，血清Hcy降低[16]；妊娠糖尿病胰島素抵抗患者血清Hcy水平升高，與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)[17]，表明MTRR基因A66G位點突變導(dǎo)致的血清Hcy水平升高可能對妊娠期孕婦有較大影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高；MTRR基因A66G位點AG、GG及G等位基因頻率顯著升高，提示C677T及A66G突變可能與不良妊娠有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點攜帶T等位基因突變、MTRR基因A66G位點攜帶G等位基因突變的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率顯著高于無T和G突變的孕婦。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點雜合子AG型、純合子GG型是不良妊娠結(jié)局發(fā)生的危險因素。提示MTHFR及MTRR基因多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生密切相關(guān)。

4 結(jié)論

MTHFR基因C677T位點存在野生CC型、雜合子CT型、純合子TT型，MTRR基因A66G位點存在野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型，MTHFR基因C677T位點及MTRR基因A66G位點多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生有關(guān)，是不良妊娠結(jié)局發(fā)生的危險因素。本研究也存在地區(qū)、人群的限制，今后可以擴大研究范圍，進(jìn)一步驗證MTHFR及MTRR基因多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系。