李彥榮 惠旭東 魏建勛

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科一病區(qū)，陜西 延安 716000)

反復(fù)自然性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是一種常見產(chǎn)科并發(fā)癥，多發(fā)生于妊娠早期，根據(jù)我國人口生育調(diào)查資料顯示，我國育齡婦女自然流產(chǎn)率約為4.26%，且呈增加趨勢，嚴(yán)重影響患者身心健康及家庭和睦[1-2]。RSA發(fā)病原因復(fù)雜，目前仍有多數(shù)患者不能明確診斷RSA發(fā)生原因，即原因不明RSA(unexplained RSA，URSA)，給臨床診療增加很大難度[3-4]。近來研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因rs1801133位點(diǎn)C-T突變與URSA有關(guān)，MTHFR是葉酸(folic acid，F(xiàn)A)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝通路中關(guān)鍵酶，MTHFR突變可使其活性降低，使FA、Hcy代謝異常，可導(dǎo)致新生兒畸形。研究[9-11]報道，MTHFRrs1801131位點(diǎn)突變與多囊卵巢綜合征、乳腺癌、不良孕產(chǎn)易感性等有關(guān)，但與URSA易感性關(guān)系尚未完全明確。因此本研究擬探討MTHFRrs1801131位點(diǎn)突變與URSA易感性的關(guān)系，以期為臨床URSA遺傳發(fā)病機(jī)制及臨床診療提供一定參考依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年8月～2019年3月本院收治的URSA患者100例為研究組，另選取同期門診體檢正常健康婦女100例為對照組。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)通過，受試者所有樣品采集及資料調(diào)查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合臨床URSA診斷。②有2次以上既往流產(chǎn)史，流產(chǎn)孕周不超過12周。③產(chǎn)科基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查正常，未發(fā)生感染跡象。④夫妻雙方染色體正常。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①至少1次正常生育史。②無內(nèi)分泌病史、甲狀腺功能亢進(jìn)等自身免疫性疾病。③無自然流產(chǎn)、死胎、難產(chǎn)等不良妊娠史。以上兩組受試者就診時均為未孕狀態(tài)，且近3個月內(nèi)未補(bǔ)充葉酸、維生素制劑，未口服避孕藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖道畸形、感染者。②合并嚴(yán)重心血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者。③合并糖尿病、高血壓、腎病史者。④有ABO或RH溶血史者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有受試者婦女清晨空腹外周肘靜脈血6 mL，其中3 mL 于1h內(nèi)3000 r/min離心5 min(有效離心半徑10 cm)，分離血清，均及時送檢或置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及MTHFR基因型檢測 提取所有受試者血液DNA，具體步驟嚴(yán)格參照DNA提取試劑盒(貨號：158422，英國QIAGEN)，MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)上游引物序列：5′-GGA GGA GGT GCT GAA GAT GTG-3′，下游引物序列：5′-TCT CCC GAG AGG TAA AGA ACA AA-3′，引物由華大基因合成。PCR反應(yīng)采用25μL體系：DNA 1.0 μL，2×Primer STAR GC Buffer 12.5 μL，dNTP 2.0 μL，Primer STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 9.25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s；64 ℃ 1 min；72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化回收(DNA純化回收試劑盒貨號：DP214-3，購自北京天根生化科技有限公司)后送上海生工生物科技有限公司測序。采用Chroms 1.62 軟件讀取測序峰圖。

1.3.3 血清空腹血糖、TG、FA、Hcy水平檢測 采用日立7020自動分析儀(日本東京)檢測受試者血清空腹血糖、Hcy、甘油三酯(TG)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清FA水平(貨號：hj-C4930，購自上海嵐派生物科技有限公司)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率(%)表示，采用2或Fisher進(jìn)行比較；計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行t檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性對URSA易感性的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 研究組患者年齡20～36歲，月經(jīng)周期28～32d；對照組患者年齡20～37歲，月經(jīng)周期28～32d。兩組患者年齡、月經(jīng)周期、BMI、血糖、血脂、FA、Hcy 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.2 兩組患者M(jìn)THFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性基因型頻率比較 研究組與對照組MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)基因型和等位基因型頻率符合Hardy -Weinberg平衡，其中AA基因型為野生基因型。與對照組比較，研究組MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)A等位基因頻率、AA基因型頻率顯著降低，C等位基因頻率、雜合及純合突變AC+CC基因型頻率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者M(jìn)THFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性基因型頻率比較[n(×10-2)]

2.3 不同基因型URSA患者FA、Hcy水平比較 與MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)AA基因型比較，AC+CC基因型患者FA水平降低，Hcy水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 不同基因型URSA患者FA、Hcy水平比較

2.4Logistic回歸分析MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性與URSA易感性的關(guān)系 攜帶AC+CC基因型、高Hcy水平、低FA水平可增加URSA易感性(P<0.05),見表4。

表4 Logistic回歸分析MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性與URSA易感性的關(guān)系

3 討論

目前臨床可確定大部分流產(chǎn)與染色體異常、子宮解剖異常、內(nèi)分泌異常、感染及自身免疫疾病等有關(guān)，但關(guān)于URSA、RSA病因及機(jī)制研究尚無定論，一直是該領(lǐng)域國際研究重點(diǎn)。近來有學(xué)者認(rèn)為，URSA可能與環(huán)境及遺傳因素有關(guān)，其中MTHFR基因突變是目前遺傳因素研究熱點(diǎn)之一[12-14]。人類MTHFR基因位于36.3位染色體，具體結(jié)構(gòu)尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因啟動子區(qū)包含CpG島、轉(zhuǎn)錄子結(jié)合位點(diǎn)及多重結(jié)合位點(diǎn)等，其編碼的蛋白質(zhì)是一種人體調(diào)節(jié)半胱氨酸及四氫葉酸代謝的關(guān)鍵酶，可將四氫葉酸催化還原為5-甲基四氫葉酸，為Hcy代謝提供必需甲基，以保證Hcy正常代謝，其多態(tài)性與婦產(chǎn)科疾病、胚胎發(fā)育有關(guān)[15]。丁想珍[16]研究報道，MTHFR基因第667位堿基基因多態(tài)性與URSA發(fā)生有關(guān)，攜帶TT基因型可增加孕婦發(fā)生URSA風(fēng)險。Xu等[17]研究報道，MTHFR1298AC基因型和復(fù)合雜合子基因型(677CT/1298AC)是URSA的危險因素。攜帶MTHFR中A1298C和C677T兩個突變位點(diǎn)的婦女發(fā)生URSA的風(fēng)險最高。但Hwang等[18]研究報道，MTHFR中A1298C和C677T兩個突變位點(diǎn)與韓國女性復(fù)發(fā)性妊娠損失無關(guān)，造成此結(jié)果差異可能與病例選擇的地域性及選擇范圍有關(guān)。本研究結(jié)果提示MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)多態(tài)性可能與本研究選擇患者USRA易感性有關(guān)。

Hcy是一種反應(yīng)性血管損傷性氨基酸，可維持正常細(xì)胞功能，F(xiàn)A缺乏會導(dǎo)致體內(nèi)Hcy增多，體內(nèi)一旦積聚過多會引起一系列病理變化，與早產(chǎn)、妊娠高血壓、胎兒異常等有關(guān)。吳姣月等[19]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中Hcy水平升高與妊娠期糖尿病、高血壓、胎兒生長發(fā)育不良等發(fā)生關(guān)系密切。林寧等[20]研究報道，孕前女性人群MTHFR基因多態(tài)性與外周血血清FA、Hcy水平相關(guān)，MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)野生型(AA)孕婦血清FA、Hcy水平與雜合(AC)、純合(CC)突變基因型孕婦均有差異。但田敏等[21]研究報道，思南縣女性MTHFR基因rs1801131基因多態(tài)性AA、AC、CC基因型間Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，rs1801133位點(diǎn)CC、CT、TT基因間Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與本研究結(jié)果不一致，可能與樣本選擇大小及地理環(huán)境位置差異有關(guān)。綜合以上研究提示MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)A>C突變，可能使MTHFR蛋白催化活性降低，引起FA水平降低，Hcy水平增加，導(dǎo)致URSA發(fā)生，攜帶C等位基因可增加URSA易感性。

4 結(jié)論

MTHFR基因rs1801131等位基因C和基因型AC、CC可能增加反復(fù)自然性流產(chǎn)易感性，可能與FA降低，Hcy水平升高有關(guān)。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關(guān)于MTHFR基因rs1801131位點(diǎn)增加URSA易感性是否還與其他位點(diǎn)基因突變或發(fā)生連鎖反應(yīng)有關(guān)，尚不完全清楚，有待進(jìn)一步加大樣本量、深入探究。