王珣 曾會 陳志娟 刁卓 司毅

(漢中市中心醫(yī)院，陜西 漢中 723000)

肝癌是一種以肝區(qū)疼痛、消化道癥狀、黃疸和腹水等為臨床癥狀的肝臟惡性腫瘤，具有侵襲力強、死亡率高的特點，其發(fā)病率逐年上升，已成為嚴重威脅人類健康的第五大惡性腫瘤[1]。由于肝癌發(fā)病早期無典型癥狀，當患者不適就醫(yī)時，多已處于肝癌中晚期，給肝癌的治療及預后帶來不良影響[2]。因此，對肝癌發(fā)生發(fā)展的過程進行深入研究，對于肝癌的診斷、治療具有重要意義[3]。研究認為，肝癌的發(fā)生可能與基因調(diào)節(jié)細胞進程的失調(diào)有關，而微小RNAs(miRNAs)的異常表達在這一過程中起到至關重要的作用[4]。miR-146b-5p是一種小分子單鏈RNA，被認為參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[5]；miR-134在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲能力方面效果顯著[6]。目前，有關miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達情況的報道較少，本研究分析miR-146b-5p和miR-134的在肝癌組織中的表達水平，探討其與肝癌患者臨床病理特征之間的關系，以期為肝癌的臨床診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月～2018年12月我院收治的原發(fā)性肝癌患者73例，取患者的原發(fā)腫瘤組織為觀察組，同時選取相對應的癌旁正常組織標本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)為對照組，均制作成3 μm切片標本。由專業(yè)病理科醫(yī)師于術(shù)中直接獲取新鮮的腫瘤組織和癌旁正常組織，腫瘤組織所取體積視病灶大小而定，盡量不要沾染到癌旁良性組織；癌旁正常組織于距離腫瘤組織邊緣>5 cm處取得，所取大小約為1 cm×1 cm×0.6 cm，分離過程中盡量不要沾染到病灶區(qū)域。取樣后立即放入液氮保存，4%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。納入標準：①臨床檢查符合原發(fā)性肝癌的診斷標準[7]：有明確的慢性肝病史；經(jīng)病理組織學檢查確診為原發(fā)性肝癌；CT或MRI影像學檢查顯示肝臟占位在動脈期快速不均質(zhì)血管強化，而靜脈期或延遲期快速洗脫；血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L，持續(xù)時間≥30 d，或AFP≥200 μg/L，持續(xù)時間≥60 d，同時可排除其他原因?qū)е碌腁FP升高。②患者均為原發(fā)病灶首次手術(shù)切除。③臨床資料完整。④患者及家屬知情同意，均簽署知情同意書。排除標準：①合并其他嚴重腫瘤疾病。②存在放化療等抗腫瘤治療史。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取肝癌組織樣品200 mg，置于研缽內(nèi)加少量液氮研磨。研磨好的樣品加入1 mL RNAiso和200 μL三氯甲烷混勻，4 ℃下離心取上清液。上清液中加入異丙醇500 μL，混勻后離心，繼續(xù)加入無水乙醇750 μL，離心后去掉上清液，靜置風干，電泳和Nanodrop檢測RNA純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScriptⅡRT試劑盒，德 國Qiagen公司)提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 qRT-PCR法檢測 在ABI7000實時PCR儀(美國Bio-rad公司)上進行qRT-PCR擴增，采用SYBR Premix試劑盒(日本TaKaRa公司)進行反應。反應條件為：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，延伸60 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)。所有樣品設3管同時擴增，取平均值。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt計算樣品中miR-146b-5p和miR-134的表達量，其中ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織。

1.3 觀察指標 比較兩組miR-146b-5p和miR-134的表達水平，并對肝癌患者的臨床病理特征與miR-146b-5p、miR-134的表達進行相關分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-146b-5p和miR-134的表達情況 miR-146b-5p和miR-134在觀察組的相對表達量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 miR-146b-5p和miR-134在兩組中的相對表達量

2.2 miR-146b-5p表達與臨床病理特征的關系 根據(jù)miR-146b-5p在觀察組中的表達狀態(tài)，將其分為高表達組(n=30)和低表達組(n=43)。miR-146b-5p的表達下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、無靜脈浸潤和TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)相關(均P<0.05)，與年齡、性別、有無肝硬化、血清AFP水平、Edmondson分級和有無腫瘤包膜等臨床病理參數(shù)無關(均P>0.05)，見表2。

2.3 miR-134表達與臨床病理特征的關系 根據(jù)miR-134在觀察組中的表達狀態(tài)，將患者分為高表達組(n=34)和低表達組(n=39)。miR-134的表達下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、有肝硬化、TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)和無腫瘤包膜相關(均P<0.05)，與年齡、性別、血清AFP水平、有無靜脈浸潤和Edmondson分級等臨床病理參數(shù)無關(均P>0.05)，見表3。

3 討論

越來越多的研究表明，miRNAs不僅參與細胞增殖、分化等生物學進程，也在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移方面，發(fā)揮著重要作用，在腫瘤的診斷、治療及預后中顯示出重要的應用價值[8]。miR-146b-5p作為一種調(diào)節(jié)多種癌基因表達的miRNA，在結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌和膠質(zhì)瘤中表達異常，提示其在惡性腫瘤中的表達模式具有特異性[9-11]。Cai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在膽囊癌組織中表達下調(diào)，并與腫瘤大小及細胞分化有關；但也有研究表明，miR-146b-5p在胃癌近端切緣組織中的高表達是導致胃癌復發(fā)較高、患者預后較差的重要危險因素[13]。miR-134是Dlkl/Di03印記基因區(qū)域的一個miRNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。研究表明，miR-134在膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)，上調(diào)miR-134的表達水平可抑制腫瘤細胞的生長與侵襲[14]。

表2 miR-146b-5p與肝癌患者臨床病理特征的關系[n(×10-2)]

表3 miR-134與肝癌患者臨床病理特征的關系

本研究結(jié)果顯示，miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的相對表達量均低于在癌旁組織中的相對表達量，提示miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達下調(diào)。miR-146b-5p的表達降低是一個不利因素，可能與肝癌細胞生長和侵襲的紊亂有關。Li等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在肝癌組織中呈低表達狀態(tài)，長鏈非編碼RNA MALAT1可下調(diào)miR-146b-5p的表達，與本研究結(jié)果一致。以往研究表明，miR-134能夠靶向干細胞相關基因，并參與調(diào)控干細胞的分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。Li等[17]的研究結(jié)果顯示，miR-134在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)，影響癌細胞的增殖、凋亡和侵襲，進一步表明miR-134的表達下調(diào)可能與癌細胞的生長和侵襲有關。為探討肝癌組織中中miR-146b-5p和miR-134與患者臨床病理特征的相關性，本研究根據(jù)miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達狀態(tài)，將患者分為高表達組和低表達組，研究結(jié)果顯示，miR-146b-5p的表達下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、無靜脈浸潤和TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)相關，miR-134的表達下調(diào)與腫瘤大小(>5 cm)、有肝硬化、TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)和無腫瘤包膜相關，但二者與患者的年齡、性別、血清AFP水平和Edmondson分級等臨床病理參數(shù)無關，提示miR-146b-5p和miR-134的表達下調(diào)可能與肝癌臨床惡性表型密切相關。TNF受體相關因子6(TRAF6)是一種泛素連接酶，被證實是miR-146b-5p在肝癌細胞中的直接靶點，二者之間的關系呈負相關。TRAF6可誘導Akt磷酸，促進腫瘤組織的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，而miR-146b-5p可降低體內(nèi)外TRAF6的表達，從而抑制肝癌腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[18]。此外，miR-146b-5p還可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，這或許也是miR-146b-5p可降低肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的原因[15]。一項有關miRNAs調(diào)節(jié)肝細胞癌細胞遷移的研究發(fā)現(xiàn)，miR-134對肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用，miR-134可通過抑制β1整合素蛋白(ITGB1)的過度表達，降低腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。此外，miR-134也可靶向K-ras基因，并控制在肝癌惡性和發(fā)展中起著重要作用的肝細胞核因子4α(HNF4α)的表達發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。因此，通過上調(diào)miR-146b-5p和miR-134在肝癌組織中的表達，或可成為肝癌治療的潛在途徑。

4 結(jié)論

肝癌組織中，miR-146b-5p和miR-134表達水平下調(diào)，可能參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展，與肝癌臨床惡性表型密切相關。由于條件限制，本研究仍存在一定不足，有關miR-146b-5p和miR-134對肝癌細胞增殖、侵襲的影響，二者的表達水平對肝癌患者預后及復發(fā)的影響等未展開研究，有待后續(xù)進一步完善。