靳 桐，印 敏，管福琴，李冬玲，佟海英，馮 煦，單 宇，①，王奇志，①

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)：a.江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京210014〕

吳茱萸屬(EvodiaJ.R.et G.Forst.)植物的提取物及單體化合物不僅具有鎮(zhèn)痛抗炎[1]、改善胃腸道功能[2]、保護(hù)心血管[3]和治療阿爾茨海默病[4]等作用，還具有抑制乳腺癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肝癌[7]和黑色素瘤[8]等腫瘤相關(guān)疾病的藥理活性。目前，對(duì)吳茱萸屬植物的研究主要集中在《中華人民共和國藥典》中收錄的吳茱萸〔E.rutaecarpa(Juss.)Benth.〕、石虎〔E.rutaecarpavar.officinalis(Dode)Huang〕和疏毛吳茱萸〔E.rutaecarpavar.bodinieri(Dode)Huang〕3種基源植物[9]。本課題組前期對(duì)吳茱萸屬植物的資源調(diào)查和化學(xué)成分動(dòng)態(tài)分析等方面進(jìn)行了研究[10-12]。依據(jù)親緣關(guān)系和生源合成途徑，同屬植物在化學(xué)成分和藥理活性方面具有相似性[13]。

鑒于此，本文以云南吳萸(EvodiaailanthifoliaPierre)、華南吳萸(E.austrosinensisHand.-Mazz.)、臭檀吳萸〔E.daniellii(Benn.)Hemsl.〕和麗江吳萸(E.delavayiDode)為研究對(duì)象，通過回流提取和分段萃取的方法獲得4種植物葉片和果實(shí)的不同極性提取物，采用MTT法測(cè)定各提取物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞(包括乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和肝癌細(xì)胞HepG2)增殖的抑制率，并考察其對(duì)正常細(xì)胞(人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HASMC)的毒性作用，從而評(píng)價(jià)其安全性，以期探究這4種吳茱萸屬植物的藥理活性，并為中藥吳茱萸的同屬植物資源在醫(yī)藥方面的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

云南吳萸、華南吳萸和麗江吳萸于2014年10月采自云南西雙版納，臭檀吳萸于2014年9月采自江蘇連云港。參照LY/T 1211—1999 中的方法，在植物停止生長前1個(gè)月左右，分別從每種植物同一植株樹冠中上部向陽面采集適量葉片和果實(shí)。以上植物樣品均由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所袁昌齊研究員鑒定，植物標(biāo)本保存于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所天然產(chǎn)物化學(xué)研究中心。

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、肝癌細(xì)胞HepG2及人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HASMC購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。高糖型DMEM培養(yǎng)基(1×)、1640培養(yǎng)基(1×)、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 取上述4種吳茱萸屬植物的葉片和果實(shí)，于55 ℃烘干至恒質(zhì)量，各取300 g，按料液比(m∶V)1∶8加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，回流提取3次，每次3 h，抽濾后合并濾液，分別用R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)減壓濃縮至流浸膏300 mL，取5 mL作為總提取物留樣；然后分別依次加入150 mL二氯甲烷和乙酸乙酯，于48 ℃水浴旋轉(zhuǎn)熱萃取3次，每次10 min，分別合并萃取液并濃縮，于55 ℃烘干至恒質(zhì)量，分別得到二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，剩余浸膏于55 ℃干燥至恒質(zhì)量作為水部位。以上浸膏各取0.1 g，用二甲基亞砜(DMSO)配置成質(zhì)量濃度10 mg·mL-1的溶液。測(cè)定前，將其加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，稀釋至給藥濃度10 μg·mL-1。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定方法 MDA-MB-231、HepG2和HASMC細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于相同方法配制的1640培養(yǎng)基中，然后置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、溫度37 ℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞傳代。取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行活性測(cè)定，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸浮液。陽性對(duì)照組為10 mg·mL-1吳茱萸堿(EVO)，溶劑為DMSO；空白對(duì)照組為不含藥物的DMSO。給藥組和陽性對(duì)照組均用培養(yǎng)液稀釋至100 μg·mL-1，空白對(duì)照組進(jìn)行同等倍數(shù)的稀釋，每孔加藥體積均為10 μL，使最終給藥濃度為10 μg·mL-1。將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h；然后向各孔中加入10 μL 5 mg·mL-1MTT(溶劑為PBS緩沖液)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后吸出培養(yǎng)液，向各孔加入100 μL DMSO，振搖10 min。用Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)在波長570 nm處測(cè)量每孔的吸光度(OD)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)公式“各部位提取率=(各部位浸膏質(zhì)量/原植物樣品干質(zhì)量)×100%”計(jì)算各部位樣品的提取率。根據(jù)公式“細(xì)胞增殖抑制率=(1-給藥組或陽性對(duì)照組的OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%”計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié) 果

2.1 4種吳茱萸屬植物葉片和果實(shí)提取物的提取率

結(jié)果表明：4種吳茱萸屬植物葉片和果實(shí)體積分?jǐn)?shù)80%乙醇總提取物(以下簡稱總提取物)的提取率在13.00%～30.35%之間，其中，云南吳萸果實(shí)的提取率最高(30.35%)，臭檀吳萸葉片及麗江吳萸葉片和果實(shí)的提取率均高于20%。

2.2 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

在10 μg·mL-1給藥濃度下，吳茱萸屬4種植物葉片和果實(shí)總提取物及其二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和水部位對(duì)3種腫瘤細(xì)胞及1種正常細(xì)胞增殖的抑制率見表1。結(jié)果顯示：云南吳萸葉片總提取物及其水部位、華南吳萸果實(shí)總提取物的乙酸乙酯部位以及臭檀吳萸果實(shí)總提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率均高于50%，云南吳萸葉片總提取物的二氯甲烷部位對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率均高于50%，云南吳萸葉片總提取物的乙酸乙酯部位對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的抑制率均高于50%，且對(duì)正常的人主動(dòng)平滑肌細(xì)胞HASMC的抑制率均低于40%，表明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性較好，可作為天然抗腫瘤物質(zhì)資源。

表1 4種吳茱萸屬植物葉片和果實(shí)乙醇提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率

本研究得到的是粗有效提取物，由于粗有效提取物中化學(xué)成分較復(fù)雜，具體發(fā)揮藥效的是哪一種或哪幾種成分還有待進(jìn)一步分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，其有效部位的提取工藝也有待進(jìn)一步研究。此外，MTT法只適用于抗腫瘤前體藥物的體外初篩實(shí)驗(yàn)，有效提取物的抗腫瘤活性還有待通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步的機(jī)制探究進(jìn)行驗(yàn)證。