張北紅，肖祖飛，張海燕，侯杰希，王顏波，李 鳳，呂雄偉，金志農(nóng)，①

〔1.南昌工程學院水利與生態(tài)工程學院 江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心，江西 南昌 330099；2.國家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045〕

檸檬醛是食品、香料和醫(yī)藥等領(lǐng)域的重要原料[1-3]，極具市場價值和開發(fā)潛力。國內(nèi)的天然檸檬醛主要來源于山雞椒〔Litseacubeba(Lour.)Pers.〕的花、葉和果皮[4-5]，而天然檸檬醛長期存在市場供應(yīng)不足的問題，因此，亟需拓展來源植物資源。

迄今為止已發(fā)現(xiàn)十余種富含檸檬醛的植物，其中樟屬(CinnamomumSchaeff.)樟組〔Sect.Camphora(Trew)Meissn.〕植物占近一半[6]。研究表明：樟組植物不同種群及個體間葉片的精油得率和主要化學成分相對含量均存在差異[7]，因此，有必要對各化學型樟組植物進行優(yōu)良單株篩選。目前關(guān)于芳樟醇型、異橙花叔醇型、桉葉油素型和腦樟型等香樟〔C.camphora(Linn.)Presl〕常見化學型的優(yōu)良單株篩選及等級劃分標準已有報道[8-9]，但未見關(guān)于檸檬醛型香樟及其他樟組植物優(yōu)良單株篩選的報道。

自然界中，檸檬醛型樟組植物的分布概率很低，如檸檬醛型香樟的分布概率不足萬分之一，檸檬醛型猴樟(C.bodinieriLévl.)和黃樟〔C.parthenoxylon(Jack)Meisn.〕的分布概率約30%，檸檬醛型沉水樟〔C.micranthum(Hay.)Hay.〕和細毛樟(C.tenuipilumKosterm.)的分布概率低于10%[10]，篩選檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株對于滿足檸檬醛市場需求具有重要意義。為此，以廣西、江西、廣東、云南、湖北和四川的48株野生檸檬醛型香樟、黃樟、細毛樟和猴樟為研究對象，對供試樣株葉片精油得率及精油中檸檬醛相對含量進行了比較，在此基礎(chǔ)上篩選優(yōu)良單株，以期為檸檬醛型樟組植物的開發(fā)利用及優(yōu)良單株等級劃分標準的制定提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

采用聞香法[10]對廣西、江西、廣東、云南、湖北和四川的野生香樟、黃樟、細毛樟和猴樟進行化學型初判，確定檸檬醛型植株并編號，采集地和樣株信息見表1。樣株種類和化學型均由江西省樟樹繁育與開發(fā)利用工程研究中心金志農(nóng)研究員鑒定。

表1 供試檸檬醛型樟組植物的采集地和樣株信息

主要儀器：自主研發(fā)的便攜式水蒸氣精油蒸餾提取設(shè)備(專利授權(quán)號：ZL201720260199.0)；MA150快速水分測定儀(德國Sartorius公司)；BSA4202S-CW精密電子天平(德國Sartorius公司)；7890B-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Aglient公司)。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 在2017年至2019年每年的5月中旬晴天日9：00至11：00，采用全株采樣法[11]采集健康、無病蟲害的當年生葉片。采樣時，將樹冠分成上、中、下3層，在各層的東、南、西、北向采集葉片，同株葉片充分混勻，4 ℃保存、備用。

1.2.2 葉片含水率測定 每株樣株隨機選3份葉片，每份6枚；沿葉中脈切開，切成面積約1 cm×1 cm的小塊；使用快速水分測定儀測定葉片含水率。

1.2.3 精油提取及檢測分析 每株樣株稱取3份葉片，每份200 g；采用水蒸氣蒸餾法[12]提取精油，稱量精油質(zhì)量，4 ℃避光保存。將同一樣株的3份精油樣品等體積混勻，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測分析，進樣量1.0 μL，檢測條件與文獻[12]一致。

根據(jù)檢測結(jié)果計算葉片精油得率，計算公式為葉片精油得率=(精油質(zhì)量/葉片鮮質(zhì)量)×(100%-葉片含水率)。采用文獻檢索法[13-14]，通過NIST標準譜庫檢索，采用保留指數(shù)進行定性分析，利用峰面積歸一化法[15]計算精油中檸檬醛的相對含量。

1.2.4 優(yōu)株篩選 參照相關(guān)文獻[8-9]的篩選方法，以各樣株葉片精油得率和檸檬醛相對含量的平均值(X0)為基準、標準差(SD)為疊加值，將供試樣株分成4個等級，各等級葉片精油得率和檸檬醛相對含量(X)如下：一級，X≥X0+2.0SD；二級，X0+1.5SD≤X

根據(jù)樣株選優(yōu)指標(λ)篩選優(yōu)良單株，λ的計算公式為λ=葉片精油得率×檸檬醛相對含量×10 000。將所有初選優(yōu)株的λ均值作為平均選優(yōu)指標(λ0)。初選優(yōu)株也分成4個等級，各等級的λ值如下：一級，λ≥λ0+2.0SD；二級，λ0+1.5SD≤λ<λ0+2.0SD；三級，λ0+SD≤λ<λ0+1.5SD；四級，λ0≤λ<λ0+SD。λ<λ0，不定級。λ值在一至四級的樣株為最終的優(yōu)良單株。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0軟件對葉片精油得率和檸檬醛相對含量進行單因素方差分析，使用EXCEL 2017軟件計算均值和變異系數(shù)等指標[16]。

2 結(jié)果和分析

2.1 檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對含量的比較分析

檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對含量的比較結(jié)果見表2。由表2可以看出：編號NM-22的樣株葉片精油得率最高，達3.64%；編號NM-45的樣株葉片精油得率最低，僅0.15%；并且，前者為后者的24.3倍。編號NM-42的樣株檸檬醛相對含量最高，達77.13%，編號NM-32的樣株檸檬醛相對含量最低，僅13.65%；并且，前者為后者的5.7倍。方差分析結(jié)果表明：樣株間的葉片精油得率存在極顯著(P<0.01)差異。供試樣株葉片精油得率的均值為1.35%，變異系數(shù)為58.78%；檸檬醛相對含量的均值為47.62%，變異系數(shù)為30.38%。

表2 檸檬醛型樟組植物葉片精油得率及精油中檸檬醛相對含量的比較

由表2還可以看出：不同種類葉片精油得率和檸檬醛相對含量的均值存在差異。從各種類葉片精油得率的均值看，香樟最高(1.79%)、黃樟次之(1.64%)、猴樟較低(1.04%)、細毛樟最低(0.66%)。從各種類檸檬醛相對含量的均值看，細毛樟最高(56.56%)、黃樟次之(51.76%)、猴樟較低(45.10%)、香樟最低(43.37%)。

由表2還可以看出：不同省(自治區(qū))葉片精油得率和檸檬醛相對含量的均值也存在差異。各省(自治區(qū))葉片精油得率均值從高到低依次為廣東、廣西、江西、四川、湖北、云南，檸檬醛相對含量均值從高到低依次為廣東、云南、江西、湖北、廣西、四川。值得注意的是，不同省(自治區(qū))同種類葉片精油得率和檸檬醛相對含量的均值存在差異，如采自廣西的香樟葉片精油得率均值為1.82%，檸檬醛相對含量均值為46.73%，而采自江西的香樟葉片精油得率均值為1.76%，檸檬醛相對含量均值為40.00%。同省(自治區(qū))不同種類葉片精油得率和檸檬醛相對含量的均值也存在差異，以采自江西的香樟和黃樟為例，黃樟葉片精油得率均值(1.44%)低于香樟，其檸檬醛相對含量均值(50.23%)高于香樟。

2.2 檸檬醛型樟組植物初選優(yōu)株的確定

分別對供試48株檸檬醛型樟組植物的葉片精油得率和檸檬醛相對含量進行分級，獲得初選優(yōu)株，結(jié)果見表3。

由表3可以看出：葉片精油得率在一至四級的樣株有22株，包括4株香樟(占香樟樣株總數(shù)的66.7%)、11株黃樟(占黃樟樣株總數(shù)的61.1%)和7株猴樟(占猴樟樣株總數(shù)的30.4%)；檸檬醛相對含量在一至四級的樣株有27株，包括3株香樟(占香樟樣株總數(shù)的50.0%)、12株黃樟(占黃樟樣株總數(shù)的66.7%)、1株細毛樟(占細毛樟樣株總數(shù)的100.0%)和11株猴樟(占猴樟樣株總數(shù)的47.8%)。統(tǒng)計結(jié)果表明：葉片精油得率和檸檬醛相對含量均在一至四級的樣株有14株，編號分別為NM-2、NM-4、NM-8、NM-9、NM-11、NM-14、NM-16、NM-19、NM-21、NM-22、NM-24、NM-26、NM-29和NM-33，這些樣株均為初選優(yōu)株。

表3 檸檬醛型樟組植物初選優(yōu)株的篩選結(jié)果1)

2.3 檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株的選擇

計算上述初選優(yōu)株的選優(yōu)指標(λ)，并依據(jù)平均選優(yōu)指標(λ0)和標準差(SD)對初選優(yōu)株進行分級，在此基礎(chǔ)上選出優(yōu)良單株，結(jié)果見表4。

表4 檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株的篩選結(jié)果

由表4可以看出：一級優(yōu)良單株僅1株，編號為NM-46；二級優(yōu)良單株無入選樣株；三級優(yōu)良單株也只有1株，編號為NM-8；四級優(yōu)良單株有6株，編號分別為NM-2、NM-4、NM-9、NM-11、NM-16和NM-24；不定級的樣株有6株，編號分別為NM-14、NM-19、NM-21、NM-26、NM-29和NM-33。

3 討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明：供試檸檬醛型樟組植物的葉片精油得率和檸檬醛相對含量在不同種類、個體及產(chǎn)地間均存在差異，這與各樣株的內(nèi)在遺傳因子和外界環(huán)境因子(坡位、坡向、土壤等)均有關(guān)[11，17-18]。猴樟和細毛樟的葉片精油得率普遍低于黃樟和香樟，這是因為猴樟和細毛樟葉片相對大而厚且革質(zhì)化程度高，葉片中精油的游離釋放難度大，精油不能被充分提取。細毛樟和黃樟葉片精油中檸檬醛相對含量較香樟和猴樟更高，這可能與細毛樟和黃樟分布地地理環(huán)境有關(guān)，相對較高的氣溫有利于次生代謝產(chǎn)物的形成和積累。不同省(自治區(qū))檸檬醛型樟組植物葉精油得率和檸檬醛相對含量受植物自身與環(huán)境條件的綜合影響，如四川廣元的猴樟，由于受該種類葉片特性影響，葉片精油得率普遍偏低，受高海拔和低氣溫等因子影響，次生代謝產(chǎn)物的合成受限，檸檬醛相對含量普遍偏低。同省(自治區(qū))同種類不同個體間的精油得率和檸檬醛相對含量也存在差異，這可能是因為不同種類的樹齡[17]、坡向[18]和坡位[19]等因子直接影響次生代謝產(chǎn)物的合成，也可能是因為土壤、肥力和林分密度[20-23]等影響植株長勢及光照強度[24]等，導(dǎo)致精油合成及檸檬醛積累受到間接影響。

本研究將葉片精油得率高于1.35%和檸檬醛相對含量高于47.62%的樣株確定為初選優(yōu)株，共選出14株初選優(yōu)株；在此基礎(chǔ)上，根據(jù)選優(yōu)指標(λ)大于121.01進行二次篩選，最終選出8株優(yōu)良單株，包括1株一級優(yōu)良單株、1株三級優(yōu)良單株和6株四級優(yōu)良單株，其中，一級優(yōu)良單株的精油得率為3.64%，檸檬醛相對含量為51.12%。篩選的8株優(yōu)良單株包括2株香樟和6株黃樟，各占相應(yīng)種類樣株數(shù)的三分之一。就目前的提取工藝而言，香樟和黃樟是檸檬醛型樟組植物優(yōu)良單株篩選的理想種類。猴樟中編號NM-36和NM-42的樣株檸檬醛相對含量分別高達77.00%和77.13%，明顯高于其余樣株，但二者的葉片精油得率均低于葉片精油得率的均值，不滿足初選優(yōu)株葉片精油得率和檸檬醛相對含量均高于均值的標準，因此，這2株樣株未能入選初選優(yōu)株。

為了排除外界環(huán)境因子的影響，建議在后續(xù)實驗中將精油得率及檸檬醛相對含量在一至三級的樣株在相同立地條件下進行比較分析。